趨化因子受體CXCR4對卵巢上皮性癌生長及侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：趨化因子是單鏈小分子蛋白質(zhì)超家族，是一類使細胞發(fā)生趨化運動的細胞因子，趨化因子行使其功能由趨化因子受體介導。CXCL12屬于趨化因子家族（過去又稱SDF-1stromal cell-derived factor-1），由基質(zhì)細胞分泌。CXCR4是一種趨化因子受體，在對卵巢癌的研究中，所觀察的14個趨化因子受體只有CXCR4在卵巢癌細胞上表達。CXCR4是CXCL12的唯一生理性受體，CXCL12又是CXCR4的唯一生理性配體，兩者

2、之間有著非常高的親和力，趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢上皮不表達CXCL12和CXCR4；卵巢癌組織高表達CXCR4：卵巢癌患者腹水和腹膜間皮細胞高表達CXCL12，因此，推測CXCL12-CXCR4生物軸在卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極其重要的作用。本研究擬在體外實驗水平探討CXCR4表達變化對卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移

3、的影響。
　　 方法：
　　 1.真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4的構(gòu)建將CXCR4基因克隆通過PCR方法獲得PCR產(chǎn)物。將空載體pReceiver-M02和PCR產(chǎn)物通過退火、酶切、連接等反應，構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4，并進行測序。使用Sequence3.0分析軟件對測序結(jié)果與GeneBank中的數(shù)據(jù)進行分析。
　　 2.穩(wěn)定表達CXCR4卵巢癌細胞株的建

4、立與鑒定利用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法，將真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4及空載體pReceiver-M02分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞SKOV3，經(jīng)G418篩選獲得了數(shù)個單細胞并將其擴大培養(yǎng)，所獲得的細胞經(jīng)RT-PCR、Western blot和免疫細胞化學方法鑒定。
　　 3.CXCL12-CXCR4相互作用在體外實驗水平對卵巢癌細胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移的影響將轉(zhuǎn)染真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4、轉(zhuǎn)染

5、空載體pReceiver-M02及親本卵巢癌細胞SKOV3進行體外培養(yǎng)。采用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法，觀察不同濃度CXCL12對三種細胞生長的影響以及CXCR4中和抗體與CXCR4拮抗劑AMD3100的抑制作用；以Transwell侵襲小室為模型，應用Matrigel探討各種濃度梯度的CXCL12對三種細胞遷移、侵襲的影響以及CXCR4中和抗體與CXCR4拮抗劑AMD3100的抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.目

6、的基因CXCR4的PCR產(chǎn)物目的基因CXCR4通過PCR方法擴增得到一條大小為1059 bp的單一特異性條帶，與CXCR4片段大小相符。
　　 2.真核表達重組質(zhì)粒的提取及測序真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4構(gòu)建成功后，進行DNA測序，結(jié)果證實CXCR4基因克隆與空載體pReceiver-M02連接順序正確，其序列與GeneBank中人CXCR4基因（NM003467）的標準序列完全一致。
　　 3

7、.穩(wěn)定表達CXCR4卵巢癌細胞株的篩選 G418的篩選濃度為600μg/ml。細胞轉(zhuǎn)染14 d后經(jīng)有限稀釋法獲得了數(shù)個單細胞，將單細胞進行擴大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細胞的形態(tài)和生長速度未發(fā)生明顯變化，伸展速度較未轉(zhuǎn)染細胞慢，將轉(zhuǎn)染真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4和空載體pReceiver-M02的細胞分別命名為SKOV3/CXCR4和SKOV3/neg細胞。
　　 4.穩(wěn)定表達CXCR4卵巢癌細胞株的鑒定轉(zhuǎn)染細胞通過R

8、T-PCR、Western blot、免疫細胞化學三種方法進行鑒定。通過上述三種方法證實轉(zhuǎn)染效率平均為73％。
　　 5.CXCL12-CXCR4相互作用對卵巢癌細胞生長的影響MTT法觀察100ng/mlCXCL12單獨作用可促進SKOV3/CXCR4細胞增殖，且能被10μg/ml CXCR4中和抗體與1μg/ml CXCR4拮抗劑AMD3100所抑制（F=256.89，P<0.05）。對于SKOV3/neg和SKOV3細胞來說

9、，加入各個濃度梯度的CXC12及CXCR4中和抗體或CXCR4拮抗劑AMD3100，細胞的生長未發(fā)生明顯變化，各組之間比較無統(tǒng)計學意義（F=0.31，P>0.05）（F=0.92，P>0.05）。
　　 6.CXCL12-CXCR4相互作用對卵巢癌細胞遷移的影響對于SKOV3/CXCR4細胞來說，100ng/ml CXCL12使遷移的細胞數(shù)明顯增多，且能被10μg/ml CXCR4中和抗體與1μg/mlCXCR4拮抗劑AMD31

10、00所抑制（F=393.21，P<0.05），對于SKOV3/neg和SKOV3細胞來說，加入各個濃度梯度的CXCL12及CXCR4中和抗體與CXCR4拮抗劑AMD3100，細胞的遷移數(shù)目未發(fā)生明顯變化，各組之間比較無統(tǒng)計學意義（F=0.41，P>0.05）（F=0.62，P>0.05）。
　　 7 CXCL12-CXCR4相互作用對卵巢癌細胞侵襲的影響當下室為無血清的培養(yǎng)液時，SKOV3/CXCR4細胞穿過Matrigel的細

11、胞數(shù)很少，CXCL12作用后，穿過Matrigel的細胞數(shù)較對照組增多；當上室加入10μg/ml CXCR4中和抗體與1μg/mlCXCR4拮抗劑AMD3100，能夠抑制細胞的趨化性侵襲（F=16.65，P<0.05）；對于SKOV3/neg和SKOV3細胞來說，加入各個濃度梯度CXCL12及CXCR4中和抗體與CXCR4拮抗劑AMD3100，各組細胞的侵襲數(shù)目相比無顯著性差異（F=0.04，P>0.05）（F=0.05，P>0.05）

12、。
　　 結(jié)論：
　　 1.真核表達重組質(zhì)粒pReceiver-M02-CXCR4構(gòu)建成功，通過測序證實；穩(wěn)定表達CXCR4卵巢癌細胞株SKOV3/CXCR4構(gòu)建成功，通過RT-PCR、Western blot，免疫細胞化學三種方法鑒定，為后續(xù)研究提供工具和平臺。
　　 2.CXCL12-CXCR4相互作用促進卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲；CXCR4中和抗體或CXCR4的拮抗劑AMD3100可抑制卵巢癌細胞的生長轉(zhuǎn)