PI3K在哮喘患者T淋巴細胞中的表達及對細胞周期影響的臨床研究.pdf

1、目的：初步了解磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）在急性發(fā)作期哮喘患者外周血T淋巴細胞中的蛋白表達情況，并觀察利用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷體外培養(yǎng)對急性哮喘患者及健康人外周血T淋巴細胞周期分布的影響，以探討PI3K參與T細胞過度活化增殖在哮喘發(fā)病機制中的作用。 方法：（1）病例采集及提純T淋巴細胞：收集2008年9月至2009年2月間20例急性發(fā)作期哮喘患者（男性12例，

2、女性8例，平均年齡30±9.6歲）作為實驗組，15例健康人（男性9例，女性6例，平均年齡28±8.9歲）為健康對照組。每一研究對象于清晨空腹時，無菌肝素抗凝抽取靜脈血5ml（哮喘患者于使用激素前），Ficoll密度梯度離心法提取獲得PBMC，尼龍毛柱法提純T淋巴細胞；（2）用Western blotting法檢測哮喘患者T淋巴細胞中PI3K Y蛋白的表達水平：將對數生長期的T淋巴細胞分為哮喘組（A組）、對照組（B組），再將哮喘組隨機分為

3、3組，分別進行檢測；（3）用MTT法觀察T淋巴細胞增殖情況：將對數生長期的哮喘患者的T淋巴細胞及正常人的T淋巴細胞分為A組（正常人不加LY294002組）、B組（正常人加LY294002組）、C組（哮喘不加LY294002組）、D組（哮喘加LY294002組），在培養(yǎng)24、48、72、96h后測定細胞增殖率；（4）用流式細胞儀檢測細胞周期的時相分布：將對數生長期的哮喘患者的T淋巴細胞及正常人的T淋巴細胞分為E組（哮喘加LY294002組

4、）、F組（哮喘不加LY294002組）、G組（正常人不加LY294002組），流式細胞儀檢測G0/G1期、S期分布。 結果：（1）Western blotting方法檢測哮喘組與對照組T淋巴細胞中磷酸化PI3Ky蛋白表達，結果顯示，與正常人相比，急性哮喘發(fā)作期患者外周血T淋巴細胞中的PI3Ky蛋白表達水平顯著上調。正常對照組外周血T淋巴細胞中PI3Ky蛋白表達較低（10945±960），哮喘組（20079±838.7），表達差異

5、顯著，有統計學意義（P<0.01）；3個哮喘組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。（2）MTT結果顯示：在24h點，A組增殖率（0.309±0.088）、B組增殖率（0.272±0.014）、C組增殖率（0.630±0.051）、D組增殖率（0.470±0.050）；在48h點A組增殖率（0.269±0.005）、B組增殖率（0.230±0.013）、C組增殖率（0.565±0.040）、D組增殖率（0.435±0.052）；在72

6、h點A組增殖率（0.309±0.009）、B組增殖率（0.272±0.014）、C組增殖率（0.627±0.051）、D組增殖率（0.473±0.050）；在96h點A組增殖率（0.274±0.007）、B組增殖率（0.245±0.010）、C組增殖率（0.587±0.046）、D組增殖率（0.410±0.041）；在24、48、72、96h時間點，A、B、C、D四組間進行組間比較，除A組與B組間差異無統計學意義以外（P>0.05），其

7、余各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。（3）將E組、F組、G組的T淋巴細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期的時相分布。結果顯示：E組G0/G1期分布比例為91.85%±7.63%，F組G0/G1期分布比例為77.40%±6.42%，G組G0/G1期分布比例為99.25%±0.01%，各組間的G0/G1期分布比例比較，差異有統計學意義（P<0.05）；E組S期分布比例為5.21%±2.33%，F組S期分布比例為19.73%±10.6