MiR-590-5P在肝癌細胞中作用的初步研究.pdf

1、第一部分、MiR-590-5P和S100A10的表達及關系分析
　　 目的：探討miR-590-5P和S100A10基因在人肝癌細胞及正常肝細胞中的表達差異。
　　 方法：培養(yǎng)人正常的肝細胞及多種肝癌細胞株，取對數(shù)生長期細胞，Trizol法提取TotalRNA，使用特異性反轉錄引物反轉錄制備cDNA，設計針對成熟體miR-590-5P的PCR檢測引物，熒光定量法檢測成熟體miR-590-5P含量。取對數(shù)生長期細胞，抽提細

2、胞總蛋白，BCA蛋白定量，Westernblot檢測S100A10蛋白含量。分析miR-590-5P及S100AA10在肝癌細胞及正常肝細胞中的表達差異。
　　 結果：熒光定量檢測結果顯示，miR-590-5P在人肝癌細胞中低表達(與正常肝細胞比較，p＜0.01);S100A10蛋白含量則在肝癌細胞中高表達。
　　 結論：miR-590-5P在人肝癌細胞中低表達,S100A10基因在人肝癌細胞中高表達，二者之間存在負相關

3、趨勢。
　　 第二部分、MiR-590-5P與S100A10間調控關系分析
　　 目的：分析miR-590-5P與S100A10表達之間可能存在的調控關系。
　　 方法：提取人基因組DNA，PCR擴增miR-590-5P前體序列，構建pcDNA-miR-590-5P重組質粒。提取人TotalRNA，反轉錄制備cDNA，PCR擴增S100A10基因的3'UTR區(qū)，將S100A10的3'UTR區(qū)克隆到PGL3-pro

4、moter熒光素酶表達載體，構建pS100A10-3’UTR-PGL3重組質粒。使用脂質體轉染的方法將報告基因重組載體及miRNA重組載體共轉染293細胞，使用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)，以海腎熒光素酶作為參照，檢測細胞干預前后熒光素酶的變化趨勢。若miR-590-5P能夠抑制pS100A10-3’UTR-PGL3報告基因的螢光素酶表達，則采用點突變的方法使S100A10-3’UTR中位于miR-590-5P上的結合位點即種子序列發(fā)生堿基突變，

5、然后通過檢測，觀察其抑制作用是否還繼續(xù)存在或消失。將慢病毒包裝質?；旌衔锛爸亟M表達載體pcDNA-miR-590-5P共轉染慢病毒包裝細胞系(293T)，采用Lv-miR-590-5P重組慢病毒進行包裝和生產(chǎn)，同時采用比例稀釋法來檢測其病毒滴度，通過預實驗來確定研究中慢病毒感染HepG2細胞的最佳MOI值。以最佳MOI值使用慢病毒顆粒對HepG2細胞進行感染，在感染72h后，檢測HepG2細胞的感染效率，然后收集HepG2細胞，再分別提

6、取其總RNA和總蛋白，采用RT-PCR和Westernblot的方法檢測miR-590-5P和S100A10之間的關系。
　　 結果：成功構建了pcDNA-miR-590-5P重組表達載體及pS100A10-3’UTR-PGL3報告基因重組質粒。在293細胞中轉染pcDNA-miR-590-5P，可以抑制pS1OOA10-3’UTR-PGL3載體表達熒光素酶，而當3’-UTR進行突變修飾后，pmir-590-5P不能夠抑制其表達

7、。通過慢病毒系統(tǒng)在HepG2細胞中高效表達mir-590-5P，細胞中mir-590-5P的過表達抑制了S100A10基因表達。
　　 結論：S100A10為miR-590-5P的靶基因。在肝癌細胞中過表達miR-590-5P,可以抑制SIOOAlO基因表達。
　　 第三部分、MiR-590-5P對于肝癌細胞HepG2的影響
　　 目的：通過慢病毒途徑在HepG2細胞中過表達miR-590-5P，觀察基因干預對于

8、細胞增殖活性，細胞周期，鈣離子濃度，細胞侵襲能力及相關蛋白含量的影響。
　　 方法：使用重組慢病毒Lv-miR-590-5P和對照病毒Lv-GFP，以最佳MOI值感染HepG2細胞，感染后72h，熒光顯微鏡下觀察細胞，通過綠色熒光蛋白(GFP)表達判斷細胞的感染效率。取病毒感染后的細胞，胰酶消化的方法制備細胞懸液，接種細胞到96孔板中，正常條件培養(yǎng)24、48、72h后，CCK-8法檢測細胞增殖活性。收集病毒感染后72h細胞，臺酚

9、藍細胞染色后進行活細胞計數(shù)，接種細胞到6孔細胞培養(yǎng)板，正常條件培養(yǎng)24h，收集對數(shù)期細胞，然后使用75％乙醇固定細胞24h，Rnase處理細胞，PI染色，通過流式細胞儀檢測細胞周期。感染后72h，胰酶消化的方法制備細胞懸液，Transwell檢測細胞侵襲能力變化。取病毒感染后的細胞，臺酚藍細胞染色后進行活細胞計數(shù)，接種細胞到6孔細胞培養(yǎng)板，正常條件培養(yǎng)24h，收集對數(shù)期細胞，進行鈣離子濃度檢測。取病毒感染后的細胞，采用胰酶消化的方法將其

10、制備成一定濃度的細胞懸液，再將接種細胞置于6孔細胞培養(yǎng)板上，在正常條件下培養(yǎng)接種細胞24h，收集對數(shù)期細胞，進行相關蛋白含量檢測。使用細胞蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。使用Westernblot檢測WNT通路相關蛋白（WNT5a、E-cadherin、Caspase3、cMyc、CyclinD1、MMP7）含量，及β-catenin蛋白磷酸化程度。并使用光密度分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。
　　 結果：

11、通過慢病毒途徑，可以在肝癌細胞HepG2中獲得100%的基因轉導效率。在肝癌細胞HepG2中過表達的miR-590-5P，不僅可以明顯抑制患者腫瘤細胞的增殖活性，還會引起其細胞周期發(fā)生停滯，進而加劇對腫瘤細胞侵襲能力的抑制作用。在肝癌細胞中過表達miR-590-5P，可明顯抑制WNT5a、cMyc、CyclinD1、MMP7蛋白表達，而促進E-cadherin、Caspase3蛋白表達，同時，miR-590-5P的過表達可引起β-cat