hWJMSCs向膀胱尿路上皮分化及抑制尿路上皮腫瘤生長的研究.pdf

1、第一部分hWJMSCs向膀胱尿路上皮細胞分化的研究
　　目的:臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstromalcellsderivedfromhumanumbilicalcordWharton'sjelly，hWJMSCs)是一群具有多向分化潛能的原始細胞。既往的研究證實，骨髓、脂肪等組織來源的MSCs在合適的條件下可以向膀胱尿路上皮細胞分化。hWJMSCs能否被誘導分化為膀胱尿路上皮細胞尚不明確。本部分中，我們旨在評估hW

2、JMSCs向膀胱尿路上皮細胞分化的可行性。方法:首先，我們采用組織塊貼壁法在從臍帶沃頓膠質(zhì)中分離獲取原代培養(yǎng)的hWJMSCs，并對其表面CD分子進行鑒定。然后，采用人膀胱尿路上皮細胞系及豬原代膀胱尿路上皮細胞來源的條件培養(yǎng)基、人表皮生長因子(EGF)對hWJMSCs進行誘導分化。針對定向分化過程中特定時間的hWJMSCs采用RT-PCR及細胞免疫熒光染色的方法檢測其尿路上皮細胞表面標記蛋白(尿斑蛋白UPⅡ、細胞角質(zhì)蛋白AE1/AE3、C

3、K18)表達情況。結果:我們原代培養(yǎng)的hWJMSCs外形均一、增殖旺盛，表達MSCs相關CD分子，不表達血源性細胞CD分子。數(shù)據(jù)顯示，在單獨使用人膀胱尿路上皮細胞系及豬原代膀胱尿路上皮細胞來源的條件培養(yǎng)基或者EGF對hWJMSCs進行分化的第7天、第14天甚至第28天均沒能檢測出尿斑蛋白UPⅡ、細胞角質(zhì)蛋白AE1/AE3、CK18的表達。而聯(lián)合使用條件培養(yǎng)基及外源性的人EGF后，hWJMSCs在被定向誘導分化第7天即有微弱的尿斑蛋白UP

4、Ⅱ、細胞角質(zhì)蛋白AE1/AE3、CK18表達，當繼續(xù)誘導分化至第14天時，上述蛋白標記物表達程度明顯增強，并且hWJMSCs形態(tài)也由長梭形向多邊形轉(zhuǎn)變。
　　結論:本課題中采用的hWJMSCs原代培養(yǎng)方法可以成功地獲取純度較高、生長旺盛的hWJMSCs，完全可以滿足本實驗的需要。無論是來源于人或豬膀胱尿路上皮細胞的條件培養(yǎng)基還是人EGF單獨使用均不足以誘導hWJMSCs向尿路上皮樣細胞定向分化。而添加有人EGF的情況下，上述條件培

5、養(yǎng)基則可以成功地誘導hWJMSCs向膀胱尿路上皮細胞進行分化。
　　第二部分hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱尿路上皮腫瘤細胞生長的研究
　　目的:有研究證實，間充質(zhì)干細胞(MSCs)可以發(fā)揮抗腫瘤的作用，但其潛在的具體分子機制目前尚不明確。近些年，細胞分泌的微囊(microvesicles，MVs)被認為是細胞與細胞之間信息傳遞的一種新途徑，因此，微囊有可能在MSCs的抗腫瘤效應中發(fā)揮了重要作用。在本部分實驗中，

6、我們旨在驗證臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(hWJMSCs)及臍帶間充質(zhì)干細胞微囊(hWJMSC-MVs)在體外及體內(nèi)對膀胱尿路上皮細胞腫瘤細胞（T24細胞）生長的抑制作用，并初步探討該現(xiàn)象背后的分子機制。方法:我們選用細胞共培養(yǎng)體系及BALB/cnu/nu裸鼠腫瘤模型分別驗證在體外及體內(nèi)環(huán)境下hWJMSCs及hWJMSC-MVs對膀胱腫瘤細胞生長的抑制作用。采用CCK-8試劑盒及Ki-67免疫染色的方法檢測hWJMSCs及hWJMSC-MVs

7、處理后的膀胱腫瘤細胞(T24)的增殖情況。采用流式細胞技術及TUNEL染色技術評估膀胱腫瘤細胞周期變化及腫瘤細胞凋亡指數(shù)的改變。為了探討hWJMSCs及hWJMSC-MVs抑制膀胱腫瘤細胞生長的信號通路，我們采用Westernblot技術檢測膀胱腫瘤細胞暴露于hWJMSC-MVs24h、48h、72h后Akt/p-Akt、p-p53、p21及Caspase3的活化及表達變化。結果:實驗數(shù)據(jù)顯示，膀胱腫瘤細胞經(jīng)過hWJMSCs及hWJMS

8、C-MVs處理后，其增殖率明顯下降，細胞周期被阻滯于G0/G1期，腫瘤細胞凋亡指數(shù)增加。Westernblot檢測顯示，hWJMSC-MVs降低了腫瘤細胞Akt磷酸化水平，激活了p53、p21及Caspase3。在動物模型中，同時皮下注射hWJMSCs或hWJMSC-MVs組的裸鼠，腫瘤成瘤率降低、瘤體體積減小。
　　結論:hWJMSCs及hWJMSCs-MVs通過阻滯腫瘤細胞周期并促進其凋亡的方式抑制膀胱腫瘤細胞的生長。并且，h