急性波動性高血糖對活體大鼠胰島素敏感性影響的研究.pdf

1、糖尿病是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的代謝性疾病,由于胰島素分泌缺乏和(或)其生物作用障礙導(dǎo)致的糖代謝紊亂,同時伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)等的代謝障礙,以慢性高血糖為主要特征。慢性高血糖常導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)和心血管等多臟器的長期損害、功能不全或衰竭。業(yè)已證實氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機制之一,活性氧(ROS)在糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機制中的之一主要是其對組織和細(xì)胞的細(xì)胞毒性損傷,ROS包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫、一氧

2、化氮(NO)等。NO可迅速和超氧化物結(jié)合形成更強的氧化劑——過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)。ONOO-可通過影響細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和離子通道、使蛋白質(zhì)發(fā)生硝基化或失活,進(jìn)而限制線粒體呼吸,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 近年來研究表明:糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展不僅與血糖整體水平升高有關(guān),而且與血糖的波動性也有密切關(guān)系,血糖波動性越高,慢性并發(fā)癥的危險性越大。國外曾進(jìn)行過一項試驗,觀察“正常血糖和高血糖交替”對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響,

3、結(jié)果發(fā)現(xiàn),“波動性高血糖組”對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷比“穩(wěn)定性高血糖組”更加嚴(yán)重。該項研究提示:波動性高血糖更能增強蛋白激酶C(PKC)活性,激活氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[1],并最終加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。臨床研究也正實:波動性高血糖可顯著增加2型糖尿病的微血管病變和心血管死亡危險[2]。反復(fù)波動的高糖環(huán)境下市,由于適應(yīng)能力欠缺,加速了細(xì)胞形態(tài)和功能的損害[3]。DCCT和UKPDS試驗的大量循證醫(yī)學(xué)研究證實嚴(yán)格控制血糖(即“強化治療”

4、)可以顯著減少糖尿病的并發(fā)癥,尤其是微血管并發(fā)癥。同時也必須看到,血糖控制越嚴(yán)格,低血糖事件的發(fā)生率越高[4,5],血糖波動的幅度越大,前者的益處在一定程度上被后者所抵消。為此,國際上提出了“精細(xì)降糖,平穩(wěn)達(dá)標(biāo)”這一新的治療理念,簡單的說,就是“既要降低高血糖,又要防止低血糖。”
　　 目的：
　　 因此,近年來國際上對血糖波動的研究正在逐漸得到重視。目前國際上關(guān)于血糖波動的研究多集中于血糖波動對動脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響,是體

5、外研究。而且目前的研究主要局限在血糖波動對糖尿病并發(fā)癥的影響,對于血糖波動對正常機體的影響有何影響;對正常機體胰島細(xì)胞及胰島素靶細(xì)胞敏感性等這些關(guān)于糖尿病發(fā)生機制的方面研究較少,特別是因為由于急性血糖波動動物模型建立的困難,所以針對急性血糖波動對機體影響的的研究,尚未見報道。本研究擬采用高濃度葡萄糖輸注的方法建立活體急性血糖波動大鼠動物模型,以組織病理學(xué)、免疫印記技術(shù)、RT-PCR等不同的檢測方法對血糖波動大鼠肝臟、脂肪、肌肉及胰腺等器

6、官進(jìn)行檢測,探討體內(nèi)血糖波動對活體大鼠機體的影響。
　　 實驗材料及方法：
　　 一、實驗動物
　　 選取7周健康雄性Wistar大鼠30只,體重280g-350g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,清潔度Ⅰ級,隨機被分為3組,分別為對照組、血糖波動組、持續(xù)高血糖組,常規(guī)飼料自由飲水,溫度22±1℃,濕度50％左右,明/暗周期為12h。
　　 二、建立持續(xù)高血糖、波動性高血糖大鼠動物模型
　　 大鼠

7、適應(yīng)實驗室環(huán)境3-5天后,用10％水合氯醛(按體重0.35mg/kg)腹腔麻醉,將聚乙烯導(dǎo)管2根,分別植入右頸內(nèi)靜脈用于輸液和左頸動脈用于采血。大鼠術(shù)后恢復(fù)5天,進(jìn)行輸液。干預(yù)因素:①對照組予0.9％生理鹽水,定時檢測血糖使血糖維持在5.5±0.5mmol/L左右,在實驗第44小時后進(jìn)行正葡萄糖-高胰島素鉗央實驗,將血糖升至20.0±0.5mmol/L,維持半小時;②血糖波動組予50％葡萄糖注射液問斷輸注,每小時檢測血糖一次,使血糖在5

8、±0.5mmol/L與20±0.5mmol/L之間波動,每1小時變動血糖值一次(即血糖控制在5mmol/L持續(xù)1小時,然后血糖控制在20mmol/L持續(xù)1小時);③持續(xù)高血糖組予50％葡萄糖注射液持續(xù)輸注,每小時檢測血糖一次,使血糖維持在20±0.5mmol/L左右。所有實驗大鼠輸液時間在48小時。輸注相應(yīng)液體48小時后,動物稱重,10％水合氯醛按0.3ml/100g腹腔注射麻醉動物,固定于解剖臺,剪去胸腹部毛發(fā),迅速開胸腹腔,心內(nèi)取血

9、5ml,3000轉(zhuǎn)/分離心15分,取上清于-70℃保存?zhèn)溆?。摘取肝臟左葉、腋下脂肪及腓腸肌標(biāo)本,速凍-70℃保存。
　　 三、主要實驗方法
　　 1、血清胰島素測定:酶聯(lián)免疫法;
　　 2、血清及組織勻漿MDA、SOD測定:比色法;
　　 3、血糖測定:采用葡萄糖氧化酶法(BIOSEN5030,德國);
　　 4、大鼠肝細(xì)胞凋亡、胰腺細(xì)胞凋亡測定:應(yīng)用TUNNEL法;
　　 5、大鼠肝臟、

10、肌肉、脂肪TNFα mRNA表達(dá)測定:應(yīng)用RT-PCR法;
　　 6、大鼠肝臟、肌肉、脂肪內(nèi)JNK1、iNOS表達(dá)測定:應(yīng)用免疫組織化學(xué);
　　 7、大鼠肝臟、肌肉及脂肪內(nèi)IRS的表達(dá):Western Blot方法;
　　 8、大鼠胰腺組織caspaso-3、Bcl-2、Bax;肝臟內(nèi)caspas-3的表達(dá)測定:應(yīng)用免疫印跡法。
　　 結(jié)果：
　　 1、各組大鼠體重及空腹血糖:各組大鼠體重(P＞0

11、.05)及空腹血糖(P＞0.05)無統(tǒng)計學(xué)差異;
　　 2、血糖波動組大鼠血清MDA/SOD比值升高,顯著高于持續(xù)性高血糖組及對照組(P＜0.01);
　　 3、血糖波動組大鼠的葡萄糖輸注率及血清胰島素2h后升高,14h達(dá)到高峰后開始下降,46h時仍高于對照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.01),48h與持續(xù)性高血糖無統(tǒng)計學(xué)差異;48h血清胰島素與胰腺組織MDA/SOD比值呈顯著的負(fù)相關(guān)(P＜0.01):
　　 4、

12、46h血糖波動組及持續(xù)性高血糖組胰島素敏感指數(shù)顯著低于于對照組(P＜0.05),而血糖波動組低于持續(xù)性高血糖組(P＜0.05);
　　 5、血糖波動組及持續(xù)性高血糖組大鼠胰腺組織內(nèi)MDA/SOD表達(dá)明顯增加,顯著高于對照組(P＜0.01),兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);血糖波動組大鼠肝臟、脂肪及骨骼肌中MDA/SOD表達(dá)明顯增加,顯著高于對照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而且以在胰腺、肝臟組織表達(dá)最顯著(P＜0.01)

13、:
　　 6、血糖波動組及持續(xù)性高血糖組大鼠胰腺組織內(nèi)cleavage caspase-3、caspase-3表達(dá)明顯增加,cleavage caspase-3/caspase比值顯著高于對照組(P＜0.01),持續(xù)性高血糖組的cleavage caspase-3/caspase比值顯著高于血糖波動組(P＜0.05);胰腺組織MDA/SOD比值與cleavage caspase-3/caspase-3比值呈強烈的正相關(guān)關(guān)系(P＜

14、0.01),血糖波動組及持續(xù)性高血糖組胰腺組織B細(xì)胞凋亡增加(P＜0.05),但兩者之間無差異;
　　 7、血糖波動組可見凋亡肝細(xì)胞,肝細(xì)胞凋亡表達(dá)顯著高于對照組和持續(xù)性高血糖組(P＜0.01);對照組和持續(xù)性高血糖組未見凋亡的肝細(xì)胞,兩組肝細(xì)胞凋亡表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異(P＞0.05);大鼠肝細(xì)胞caspase-3:血糖波動組肝細(xì)胞內(nèi)caspase-3及cleavage oaspase-3表達(dá)顯著高于對照組(P＜0.01)

15、及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05)。
　　 8、血糖波動組大鼠肝臟、脂肪及骨骼肌中JNK1、iNOS表達(dá)明顯增加,顯著高于對照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而且以在肝臟組織表達(dá)最顯著(P＜0.01);MDA/SOD比值與JNK1、iNOS呈顯著強烈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01):
　　 9、血糖波動組大鼠肝臟、脂肪TNFα mRNA表達(dá)明顯增加,顯著高于對照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而且以在肝臟組織表達(dá)最顯著(

16、P＜0.01);三組骨骼肌組織中TNFα mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);
　　 10、血糖波動組大鼠肝臟及脂肪組織中IRS-1的表達(dá)顯著下降,顯著低于對照組及持續(xù)性高血糖組(P＜0.05),而三組骨骼肌組織中IRS-1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);肝臟組織內(nèi)IRS-1的表達(dá)與SI呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01);
　　 結(jié)論：
　　 1、通過輸注高濃度葡萄糖注射液,可以建立活體急性波動性高血糖雄性Wi

17、star大鼠動物模型;
　　 2、急性波動性高血糖誘導(dǎo)雄性Wistar大鼠體內(nèi)ROS產(chǎn)生增多,氧化應(yīng)激水平增強,導(dǎo)致胰島素分泌水平及胰島素敏感性下降,機體出現(xiàn)胰島功能障礙及胰島素抵抗;
　　 3、急性波動性高血糖導(dǎo)致雄性Wistar大鼠胰腺、肝臟、脂肪及骨骼肌組織中ROS產(chǎn)生增加,其中對胰腺及肝臟組織的影響最為嚴(yán)重,并導(dǎo)致caspase-3激活,導(dǎo)致肝細(xì)胞及胰島β細(xì)胞凋亡增加;
　　 4、急性波動性高血糖誘導(dǎo)大鼠

18、肝細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生顯著增加導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡顯著增加的主要病理生理機制是急性血糖波動導(dǎo)致iNOS表達(dá)顯著增加,進(jìn)而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生顯著增加,后者促進(jìn)TNFα表達(dá)顯著增加:TNFα激活I(lǐng)NK1細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,使肝細(xì)胞內(nèi)caspase-3激活,導(dǎo)致急性血糖波動組大鼠體內(nèi)肝細(xì)胞的凋亡顯著增加。
　　 5、急性波動性高血糖時,大鼠體內(nèi)肝臟及脂肪組織中IRS-1表達(dá)顯著較少,可能是急性波動性高血糖導(dǎo)致活體大鼠體內(nèi)胰島素敏感性顯著降低的主要病理