小膠質細胞介導多巴胺能神經元損傷的機制及干預研究.pdf

1、課題目的1.建立小膠質細胞激活介導神經元損傷實驗體系和藥物篩選體系.2.檢驗該體系的可行性和可信性.3.在體研究EGCG對小膠質細胞激活的抑制作用.4.體外深入研究EGCG對小膠質細胞激活的抑制作用及其機制.采用方法1.在原代中腦腹側多巴胺能神經元培養(yǎng)培養(yǎng)體系上,利用1-甲基-4-苯基吡啶(Mpp+)造成選擇性多巴胺能神經元損傷細胞模型,給予不同劑量EGCG,免疫細胞化學染色方法標記酪氨酸羥化酶(TH)觀察不同劑量EGCG對陽性細胞數(shù)目

2、的影響.2.通過體視學方法觀察不同劑量EGCG對1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四羥吡啶(MPTP)所致C57BL/6小鼠選擇性多巴胺能神經元損傷這一經典動物模型中腦TH陽性細胞數(shù)目的影響,同時利用小膠質細胞膜抗原CD11b標記小膠質細胞,觀察EGCG對小膠質細胞激活的作用.3.通過兩種不同的方法--選擇性貼附振搖分離法和溫和消化法獲取純化的小膠質細胞,利用Dil-ac-LDL標記技術、Greiss反應和ELISA方法,比較這兩種方法

3、的得率、所獲小膠質細胞的純度、形態(tài)和生物學特性如釋放NO和TNF-α這兩種重要的與炎癥反應有關的細胞因子的能力.4.全反式維甲酸誘導人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞分化為具有多巴胺能神經元特性的細胞.利用該細胞模型,采用MTT方法和3H標記多巴胺攝取作用,觀察細菌脂多糖(LPS)激活小膠質細胞條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y的損傷作用.5.在高度純化的小膠質細胞培養(yǎng)體系中,利用Dil-ac-LDL原位標記技術,觀察EGCG對小膠質細胞激活所

4、致的形態(tài)學改變、NO和TNF-α釋放的抑制作用.6.更進一步,用免疫印記方法(Western blotting)和反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)研究EGCG對NO和TNF-α釋放的抑制作用是否通過下調誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-αmRNA而實現(xiàn).7.結合溫和消化法分離小膠質細胞技術和SH-SY5Y誘導分化細胞模型,通過系列濃度LPS的刺激和所產條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y的損傷作用,檢驗該系統(tǒng)的可行性.8.最后,利用原代中