微囊化神經(jīng)組織聯(lián)合脫細胞神經(jīng)移植修復犬坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究.pdf

1、本研究擬通過以海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉（Algin-Polylysine-Algin，APA）成分構(gòu)成的微膠囊包裹大鼠坐骨神經(jīng)組織，以化學萃取獲得脫細胞的犬同種異體神經(jīng)，將二者聯(lián)合移植修復不同長度的犬坐骨神經(jīng)缺損，研究針對“再細胞化”的脫細胞神經(jīng)在神經(jīng)修復再生中的作用和意義，為探索自體神經(jīng)移植的替代方案方法提供理論和實驗依據(jù)。 第一部分犬脫細胞同種異體神經(jīng)的構(gòu)建。 目的：構(gòu)建犬脫細胞同種異體神經(jīng)。 方法：健

2、康雜種犬10只，體重在10kg-15kg之間，健康雌性Wistar大鼠5只，體重在220-250g之間。采用Triton-Ⅹ100和脫氧膽酸鈉通過化學萃取方法來處理新鮮犬坐骨神經(jīng)。鈷-60γ射線輻照消毒滅菌后，通過大體觀察、光鏡觀察、掃描電鏡觀察評價其組織形態(tài).大鼠行脫細胞神經(jīng)背部肌肉包埋實驗，術(shù)后1周取出脫細胞神經(jīng)作石蠟切片，HE染色；評價生物相容性。 結(jié)果：經(jīng)過化學萃取后支架呈半透明狀，較新鮮神經(jīng)略有收縮。光鏡觀察、掃描電鏡

3、觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞成分殘留，僅剩下較完整的基底膜管道。肌肉包埋實驗后1周支架周圍有輕微的炎癥反應，周圍肌肉無明顯壞死。 第二部分微囊化大鼠神經(jīng)組織的制備及其生物活性的研究。 目的：使用APA材料制備微囊化大鼠神經(jīng)組織，并評價其移植體內(nèi)后的生物活性， 方法：健康雌性Wistar大鼠5只，體重在220-250g之間，健康雄性昆明鼠20只，體重20～25g.切取大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)在胰酶消化下形成細胞組織塊，使用APA

4、材料利用微囊靜電發(fā)生器將神經(jīng)組織包裹，制成微囊化神經(jīng)組織，采用注射的方法將一定數(shù)量的微囊化神經(jīng)組織移植到小鼠的腹腔，術(shù)后6周回收微囊，計算回收率，接著對其體外培養(yǎng)3天，采用四唑鹽（MTT）法、ELISA法檢測NGF含量以及對回收微囊內(nèi)神經(jīng)組織進行再培養(yǎng)觀察其生長情況等方法，綜合評價其活性。 結(jié)果：微囊化神經(jīng)組織移植體內(nèi)6周后外型基本保持完整，回收率位于80～90％，MTT法、ELISA法均檢測出囊內(nèi)神經(jīng)組織細胞仍有活性，將微囊內(nèi)

5、神經(jīng)組織再培養(yǎng)時觀察到細胞仍可貼壁，生長良好。 第三部分微囊化神經(jīng)組織聯(lián)合脫細胞神經(jīng)移植修復犬坐骨神經(jīng)短段缺損后靶肌肉變化的研究。 目的：了解微囊化神經(jīng)組織細胞與脫細胞神經(jīng)聯(lián)合移植橋接犬坐骨神經(jīng)3cm缺損后腓腸肌的相應變化， 方法：將犬24只隨機分為A、B、C3組，每組8只。所有動物均人為手術(shù)造成單側(cè)坐骨神經(jīng)3cm缺損，A組：脫細胞神經(jīng)輔加微囊化神經(jīng)移植修復缺損；B組：單純脫細胞神經(jīng)移植修復缺損；C組：自體神經(jīng)切

6、斷后原位倒置修復，術(shù)后定期觀察犬的運動功能恢復情況，并于術(shù)后6個月、12個月行移植段神經(jīng)運動傳導速度檢測，并切取雙側(cè)腓腸肌行琥珀酸脫氫酶（SDH）、突觸素、運動終板染色，同時取脫細胞神經(jīng)移植遠端吻合口以遠1cm處的神經(jīng)行HE染色、MASSON染色、固藍染色、S-100免疫組化染色、NF-200免疫組化染色等形態(tài)學檢測。 結(jié)果：所有實驗動物均納入實驗動物數(shù)量分析、無脫失。術(shù)后運動功能恢復及電生理檢測方面，A、C組間差別不大，但明顯

7、優(yōu)于B組.圖象分析表明A組在術(shù)后6個月、12個月腓腸肌SDH光密度、肌纖維截面積、突觸素及膽堿脂酶光密度和面積方面明顯優(yōu)于B組，而與C組無明顯差別，脫細胞神經(jīng)移植段吻合口遠端神經(jīng)形態(tài)學檢測符合靶肌肉檢測結(jié)論。 第四部分微囊化神經(jīng)組織聯(lián)合脫細胞神經(jīng)移植修復犬坐骨神經(jīng)中長段缺損后靶肌肉的研究。 目的：了解微囊化神經(jīng)組織細胞與脫細胞神經(jīng)聯(lián)合移植橋接犬坐骨神經(jīng)6cm缺損后腓腸肌的相應變化。 方法：將犬24只隨機分為D、E

8、、F3組，每組8只。所有動物均人為手術(shù)造成單側(cè)坐骨神經(jīng)6cm缺損，D組：脫細胞神經(jīng)輔加微囊化神經(jīng)移植修復缺損；B組：單純脫細胞神經(jīng)移植修復缺損；C組：自體神經(jīng)切斷后原位倒置修復。術(shù)后定期觀察犬的運動功能恢復情況，于術(shù)后6個月、12個月行移植段神經(jīng)運動傳導速度檢測，并切取雙側(cè)腓腸肌行琥珀酸脫氫酶（SDH）、突觸素、膽堿脂酶運動終板染色，同時取脫細胞神經(jīng)移植遠端吻合口以遠1cm處的神經(jīng)行HE染色、MASSON染色、固藍染色、S-100免疫組

9、化染色、NF-200免疫組化染色等形態(tài)學檢測。 結(jié)果：所有實驗動物均納入實驗動物數(shù)量分析、無脫失。術(shù)后運動功能恢復情況及電生理檢測，D、E、F組較術(shù)前均有明顯差距，D、F組間差別不大，相對E組而言恢復效果要好，圖象分析表明D組在術(shù)后6個月、12個月腓腸肌SDH光密度、肌纖維截面積、突觸素及膽堿脂酶光密度和面積方面明顯優(yōu)于E組，而與F組無明顯差別，脫細胞神經(jīng)移植段吻合口遠端神經(jīng)形態(tài)學檢測符合靶肌肉檢測結(jié)論。 結(jié)論：

10、 [1]通過化學萃取脫細胞方法制備的脫細胞神經(jīng)具有正常神經(jīng)的天然孔隙和三維空間結(jié)構(gòu)，材料的免疫原性基本上被去除，具有良好的細胞相容性和組織相容性。 [2]微囊化神經(jīng)組織可在體內(nèi)保持活性至少6周，囊內(nèi)的細胞可正常生存并保持增殖功能，將其移植至體內(nèi)以達到對脫細胞神經(jīng)“再細胞化”是安全可行的. [3]微囊化神經(jīng)組織與脫細胞神經(jīng)聯(lián)合移植修復短段（3cm）神經(jīng)缺損后，在較短時間內(nèi)大量神經(jīng)纖維重新支配靶器官，使腓腸肌萎縮明顯減弱，效

11、果明顯優(yōu)于單純脫細胞神經(jīng)移植，與自體神經(jīng)移植效果無顯著差異性，單純脫細胞神經(jīng)移植效果似也在可勉強接受的水平，至于遠期效果比較是否存在差異以及更長距離的再細胞化的必要性等問題仍需進一步深入研究. [4]微囊化神經(jīng)組織與脫細胞神經(jīng)聯(lián)合移植修復中長段（6cm）神經(jīng)缺損后，在一定時間內(nèi)相當數(shù)量的神經(jīng)纖維重新支配靶器官，使腓腸肌萎縮減弱得到一定程度的緩解，與自體神經(jīng)移植效果無明顯差異，盡管較之正常水平仍有不小的差距，但其效果明顯優(yōu)于單純脫