脫細胞神經支架復合骨髓間充質細胞修復大鼠坐骨神經缺損.pdf

1、目的: 顯微外科技術的發(fā)展極大地提高了周圍神經損傷修復的質量，但修復由創(chuàng)傷、腫瘤切除以及先天性畸形等原因引起的較嚴重周圍神經缺損時效果欠佳。修復與重建是周圍神經組織工程研究的熱點問題。在臨床上，周圍神經損傷后自體神經移植是首選的神經重建方法，但存在著感覺恢復不全或感覺障礙、供體來源受限、手術時間過長等缺點。高分子聚合材料PDLLA、PLGA等已被制成神經導管用于修復周圍神經缺損的實驗研究，但因缺乏支持神經再生的活性細胞，神經再生

2、的細胞外基質成分、生長因子等，不具備正常神經結構而影響神經再生效果。本研究的目的：①采用脫細胞神經基質移植物(ANA)體外誘導骨髓間充質細胞(BMSCs)分化為施萬細胞樣細胞。探討ANA誘導BMSCs向施萬細胞方向分化的可行性，為體外誘導BMSCs向施萬細胞方向的分化提供新的思路，為周圍神經組織工程提供來源方便的種子細胞奠定實驗基礎。②觀察脫細胞神經支架復合骨髓間充質細胞、構建組織工程化人工神經，修復大鼠坐骨神經缺損的效果，為神經組織工

3、程研究與臨床應用提供實驗依據(jù)。 材料和方法: 1、取3w齡SD大鼠一只，脫臼處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，5ml注射器沖洗骨髓腔，收集沖洗液離心，制成單細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，貼壁法分離、純化、增殖骨髓間充質細胞，以ANA勻漿做誘導劑，對體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質細胞進行表型鑒定，取第5代細胞進行誘導，誘導組加入ANA勻漿液，未誘導組加入等量培養(yǎng)基； 2、加入誘導劑后每6h觀察細胞形態(tài)變化，免疫細胞化學染色和流

4、式細胞儀分別檢測細胞中S-100、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達情況；RT-PCR檢測誘導前后細胞GFAP及S-100 mRNA表達的變化；MTT法檢測不同誘導劑濃度誘導后的細胞活性； 3、取傳至5代的BMSCs與脫細胞神經支架復合培養(yǎng)，構建移植物。SD成年大鼠18只，隨機均分為3組：①實驗組(ANA復合BMSCs移植)；②支架組(ANA移植)；③對照組(自體神經移植)。術后12W，采用坐骨神經功能指數(shù)測定、腓腸肌濕質量

5、恢復率檢測及組織學等方法評價神經缺損的修復效果。 結果: 1、培養(yǎng)純化第5代的細胞CD44+，CD54+，CD34-；免疫細胞化學染色顯示：誘導后細胞GFAP，S-100陽性細胞比例分別為(64±5)％，(42±4)％，未誘導的細胞二者均無陽性表達；流式細胞儀檢測誘導后的細胞GFAP及S-100表達較未誘導細胞升高；RT-PCR反應顯示誘導后的細胞表達GFAP及S-100，未誘導細胞二者均不表達；MTT法檢測結果表明誘導

6、劑濃度為1.0mg/ml時誘導后有活性細胞數(shù)最多； 2、坐骨神經功能指數(shù)及腓腸肌濕質量恢復率的檢測顯示實驗組優(yōu)于支架組，與對照組相似；組織學檢查，實驗組修復神經S-100蛋白表達明顯強于支架組，足底皮膚單位面積內觸覺小體數(shù)明顯多于支架組，實驗組縫合神經有效神經截面積、有髓神經纖維數(shù)目、有髓神經纖維密度、有髓神經纖維直徑、髓鞘厚度均優(yōu)于支架組，其坐骨神經缺損修復效果接近對照組。 結論: 1、脫細胞神經支架可誘導骨髓