耐受性樹突狀細胞治療小鼠炎癥性腸病的療效研究.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)。本病以腸道炎癥和粘膜組織損傷為特征，其病因及發(fā)病機制尚未完全明確。目前得到基本認同的觀點為:環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道共生菌的參與下，啟動了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導致免疫反應及炎癥過程。腸道粘膜免疫系統(tǒng)在

2、IBD腸道炎癥發(fā)生、發(fā)展及轉歸過程中始終發(fā)揮重要作用，因此調節(jié)腸道免疫反應，恢復腸道粘膜免疫耐受成為IBD治療的關鍵。
　　樹突狀細胞(Dendritic cell，DCs)是目前已知的功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell，APC)，是唯一能夠激活初始型T細胞的APC，研究表明DCs是一類異質性細胞群體，具有不同的亞群和不同的功能狀態(tài)，不僅能夠遞呈抗原激活免疫細胞誘發(fā)免疫應答，而且可以誘導胸腺

3、清除自身反應性細胞、分化調節(jié)性T細胞維持自身免疫耐受，因此DCs成為介導免疫應答與耐受的關鍵。DCs在成熟過程中表型和功能會發(fā)生明顯變化，非成熟型或半成熟型DCs表現為耐受活性，這種活性隨著DCs的成熟而轉變?yōu)槊庖咴浴?br>　　胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)由Friend等于1994年從胸腺基質細胞中首次分離鑒定，隨著研究的深入，TSLP在免疫應答中的作用引起了人們的廣泛

4、關注。TSLP可直接活化DCs，微弱上調DCs表面的HLA-DR和CD86的表達，強烈誘導共刺激分子CD40和CD80的表達，并選擇性激活病理性Th2型細胞反應，從而在過敏、炎癥及免疫疾病中扮演重要的角色。IBD作為腸道慢性炎癥性疾病，其發(fā)生發(fā)展與免疫、炎癥及過敏反應密切相關，目前TSLP在IBD發(fā)病中的作用尚未明確，有研究表明與過敏性疾病中TSLP的致病性不同，TSLP對于腸道炎癥具有保護作用，TSLPR基因敲除小鼠建立的IBD動物模

5、型，獲得了較正常對照組更為嚴重的腸道炎癥反應。Besin G等應用TSLP-conditioned-DCs成功治療了小鼠的糖尿病，提示TSLP條件化的DCs具有耐受性表型，而TSLP-conditioned-DCs是否對于IBD具有治療作用目前國內外均未見報道，為了回答此問題并深入探討TSLP在腸道免疫中的作用及機制，我們進行如下研究。
　　材料和方法:
　　一、材料
　　2-3周齡的純系雌性NOD小鼠，SPF級，周齡

6、2～3w，體重10～12g;雌性Balb/c小鼠，SPF級，周齡8～10w，體重22～25g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，室內溫度20±2℃，相對濕度為50％，自然光線采光，日照時間為12小時，常規(guī)飲水，普通專用飼料喂養(yǎng)。
　　二、主要試劑
　　mouse GM-CSF Peprotech公司;mouse IL-4 Peprotech公司;mouse TSLPRD公司;胎牛血清Hyclone公司;RPMI1640細胞培養(yǎng)

7、液Hyclone公司;FITC-CD11c熒光抗體eBioscience公司;PE-CD40熒光抗體eBioscience公司;PE-CD80熒光抗體eBioscience公司;PE-CD86熒光抗體eBioscience公司;PE-MCHII熒光抗體eBioscience公司;FITC-CD4熒光抗體eBioscience公司;PE-IFN-γ熒光抗體eBioscience公司;PE-IL-4熒光抗體eBioscience公司;PE-

8、CD25熒光抗體eBioscience公司;小鼠TNF-α ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-12 ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-10 ELISA試劑盒RD公司;脂多糖sigma公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS) sigma公司;小鼠IFN-γ ELISA試劑盒RD公司;SYBR Prime Script Real-Time PCR Kit（TakaRa，DRR063s，大連寶生物工程有限公司）;目的基因和內參引物DNA

9、（TakaRa Custom DNA，由寶生物工程（大連）有限公司設計）;小鼠IL-1β ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-4 ELISA試劑盒RD公司;小鼠IL-17 ELISA試劑盒RD公司。
　　三、主要儀器和設備
　　倒置顯微鏡;低溫高速離心機(Eppendof);超低溫冰箱;超凈工作臺;流式細胞儀(FACS Calibur，BD Bioscience);全自動ELISA分析儀(BioTek，ELx808);Lig

10、ht Cycler Real Time PCR擴增儀(Roche)
　　四、實驗方法
　?。ㄒ唬┬∈蠊撬柙葱詷渫粻罴毎捏w外培養(yǎng)及表型鑒定
　　采集NOD小鼠骨髓細胞，于體外應用GM-CSF誘導分化，培養(yǎng)細胞分為三組，一組不加干預，另兩組于第六日分別給予TSLP及LPS刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后收集細胞應用流式細胞術檢測細胞表型，并收集細胞培養(yǎng)上清液檢測IL-10、IL-12、TNF-α的表達。
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11、BS建立小鼠炎癥性腸病模型
　　分別應用100mg/kgTNBS+無水乙醇、150mg/kgTNBS+50％乙醇及100mg/kgTNBS+25％乙醇溶液灌腸，建立Balb/c小鼠炎癥性腸病動物模型。造模后觀察小鼠一般狀態(tài)，DAI評分，大體形態(tài)損傷評分，病理組織學評分，了解不同配比灌腸液誘導IBD動物模型的效果及疾病嚴重程度的變化趨勢，收集腸系膜淋巴結細胞及脾臟淋巴細胞進行體外培養(yǎng)，三日后收集細胞培養(yǎng)上清液應用ELISA法檢測細胞

12、因子IL-4和IFN-γ的表達，收集細胞應用流式細胞術檢測腸系膜淋巴結及脾臟淋巴細胞中CD4+IFN-γ+及CD4+IL-4+雙陽性T細胞的表達率。
　?。ㄈ└深A實驗
　　分別應用PBS、TSLP-DCs、TSLP-腹腔注射、TSLP灌腸、imDCs于IBD小鼠模型建立后3小時進行干預治療，并連續(xù)三日給藥，每日觀察小鼠生存率、一般狀態(tài)、DAI評分，三日后處死小鼠，評估大體損傷程度，取遠端結腸組織進行H-E染色觀察病理改變進

13、行病理組織評分;取中段結腸組織均漿后應用ELISA法檢測IL-17、IL-1β、IL-23、IL-4的表達;取近端結腸組織應用real-time PCR法檢測IL-4、IL-17、IL-23、IL-1β、INF-γ、IL-10、IL-6、Foxp3的表達;收集腸系膜淋巴結細胞，培養(yǎng)三日后收集細胞應用流式細胞術檢測CD4+CD25+調節(jié)性T（regulatory t cell Tregs）細胞的表達率。
　?。ㄋ模┙y(tǒng)計分析
　

14、　所有數據采用Mean±SD來表示，差異比較采用SPSS17.0軟件進行分析，組間比較采用獨立樣本的t檢驗及方差分析，p＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1、應用GM-CSF于體外可誘導小鼠骨髓細胞產生樹突狀細胞。
　　2、TSLP處理的DCs表現為半成熟DCs表型，其細胞培養(yǎng)液中分泌較高濃度抑制性細胞因子IL-10，而炎癥性細胞因子TNF-α及IL-12的濃度明顯降低。
　　3、應用TNBS+乙醇一

15、次性灌腸可建立IBD動物模型，100mg/kg TNBS+無水乙醇一次性灌腸建立的小鼠模型腸道炎癥明顯，而且小鼠存活率高，造模后第三日疾病嚴重程度最明顯。
　　4、應用100mg/kgTNBS+無水乙醇建立的IBD小鼠模型，結腸炎癥以Th1型細胞反應為主，結合其大體損傷及病理改變提示該方案建立的動物模型與人類的Crohn病相似。
　　5、TSLP-DCs干預治療明顯提高了IBD小鼠的存活率，小鼠一般狀態(tài)、DAI評分、大體損傷

16、評分及病理組織評分明顯好于對照組，TSLP-腹腔注射組加重了小鼠結腸炎癥改變，TSLP灌腸及imDCs治療組改善了IBD小鼠的結腸炎癥，但其疾病評分及病理組織評分不優(yōu)于TSLP-DCs治療組。
　　6、TSLP-DCs干預治療促進小鼠結腸組織Th2型細胞因子（IL-4、IL-10）的產生，而明顯抑制了Th1型（IL-1β、IL-6、INF-γ）及TH17型（IL-17、IL-23）細胞因子的產生;TSLP-DCs干預治療組小鼠腸系

17、膜淋巴結調節(jié)性T細胞表達率明顯增高，且調節(jié)性T細胞的特異性轉錄因子Foxp3的表達明顯增高。提示TSLP-DCs干預治療改善了IBD小鼠的結腸炎癥可能通過調節(jié)Th1/Th2及Th17/Tregs的平衡而獲得。
　　7、與TSLP-腹腔注射組加重小鼠腸道炎癥反應不同，TSLP灌腸組改善了IBD小鼠的結腸炎癥，提示TSLP于不同的組織器官作用不同，其機制可能與組織微環(huán)境及DCs的亞群相關，由此可見進一步研究腸道DCs的功能特征成為進一