丹參對小鼠炎癥性腸病的治療作用及機制研究.pdf

1、前言：
　　 炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease,IBD)是指一組病因尚不清楚的慢性非特異性的腸道炎癥性疾病,包括兩個獨立的疾病,潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,UC)和克羅恩病(Crohn’sdisease,CD)。近年來IBD在世界范圍包括我國在內(nèi)發(fā)病率持續(xù)增高,逐漸成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因。IBD具有慢性,持續(xù)性和復(fù)發(fā)性的特點,可發(fā)生中毒性巨結(jié)腸、腸穿孔、腸出血、

2、腸梗阻及大腸癌變,嚴(yán)重影響人民群眾的生活健康,形成巨大的社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
　　 IBD的病因?qū)W和治療學(xué)研究一直是該領(lǐng)域的研究重點,目前大多數(shù)研究者認(rèn)為,該病的發(fā)病多與環(huán)境、遺傳和免疫學(xué)因素有關(guān),是一種多基因參與的作用于免疫系統(tǒng)和靶器官的疾病,而免疫學(xué)因素在其發(fā)病過程中起至關(guān)重要的作用。近年來的研究表明CD是一種典型的Th1型反應(yīng),而UC則是一種非典型的Th2型反應(yīng),除免疫細(xì)胞外,腸道粘膜的非免疫細(xì)胞如上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)

3、胞等亦參與免疫反應(yīng)和炎癥過程,它們釋放出各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展,調(diào)節(jié)某些細(xì)胞因子的表達(dá)可以治療IBD,如給予白介素(interleukin,IL)10治療UC,給予抗腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα,TNFα)單克隆抗體治療CD都取得較好的效果。
　　 Th1和Th2細(xì)胞因子都會促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展,而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells,Treg)則可抑制Th1及Th2

4、細(xì)胞的功能,對固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都有抑制作用,在多種免疫性疾病中起重要調(diào)節(jié)作用。根據(jù)其表面標(biāo)記和分泌的細(xì)胞因子及作用機制不同,Treg可分為CD4+CD25+Treg、Tr1和Th3細(xì)胞等多種亞型,Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異性表達(dá)因子,是Th0細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化的標(biāo)志。Treg細(xì)胞可通過接觸抑制Th1和Th2細(xì)胞,亦可通過分泌TGF-β和IL-10產(chǎn)生廣泛非特異性的抑炎作用。而當(dāng)Treg細(xì)胞功能紊亂和調(diào)

5、節(jié)缺陷時,腸黏膜局部就會產(chǎn)生持續(xù)的炎癥反應(yīng),這可能是IBD的發(fā)病機制之一。
　　 目前IBD的治療主要從影響機體的免疫功能入手,治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑和中藥,不良反應(yīng)嚴(yán)重或價格昂貴是氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑的不足之處,限制了其長期應(yīng)用,而中藥相對而言不良反應(yīng)輕,價格低廉,供應(yīng)充足,可作為輔助用藥,提高療效,減少常規(guī)治療引起的不良反應(yīng)。其中丹參是一種廣泛應(yīng)用的中藥,常用

6、于治療炎性腸病,機制不明。有研究表明分離正常人外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,在體外培養(yǎng)中用人腸道厭氧菌抗原刺激單核細(xì)胞,然后將激活的單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng),再加入丹參,檢測發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞中CD25及Foxp3雙陽細(xì)胞的百分比明顯升高,同時CD4+CD25+細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)率也顯著升高,丹參可能通過維持調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分化平衡來發(fā)揮其治療作用,但體內(nèi)作用未有研究闡明,本研究的目的是明確丹參對體內(nèi)CD8+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化

7、及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響,為丹參用于治療IBD提供依據(jù)。
　　 實驗材料及方法：
　　 一、動物模型及分組
　　 健康6-8周齡SPF級BALB/C小鼠50只,體重18-21克,雌雄各半,由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。根據(jù)腹腔注射藥物的不同將BALB/C小鼠用隨機數(shù)字表法分為5組,每組10只,給予含1%(W/V)三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)的30%

8、7.醇溶液以100mg/kg(10ml/kg)體重灌腸,建立炎癥性腸病模型,造模成功后各組處置如下:
　　 A組:無處置;
　　 B組:生理鹽水10ml/kg腹腔注射,連續(xù)14天;
　　 C組:2%丹參生理鹽水10ml/kg腹腔注射,連續(xù)14天;
　　 D組:4%丹參生理鹽水10ml/kg腹腔注射,連續(xù)14天;
　　 E組:6%丹參生理鹽水10ml/kg腹腔注射,連續(xù)14天。
　　 實驗第

9、8天和第15天麻醉處死動物,留取脾和結(jié)腸標(biāo)本,其中死亡動物不列入研究。
　　 二、實驗標(biāo)本采集及處理
　　 造模后觀察動物一般狀況、糞便情況及稱量體重,在第8天和第15天收集糞便測定大便隱血分?jǐn)?shù),進(jìn)行疾病活動度指數(shù)(diseaseactivityindex,DAI)評分。同時給予10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,處死,按以下方式留取標(biāo)本:
　　 1、留取距肛門4cm左右的結(jié)腸組織0.5cm,經(jīng)4%多聚甲醛溶

10、液固定,行病理切片,H-E染色,做病理組織學(xué)計分,做免疫組化染色。
　　 2、取病變部位結(jié)腸組織,檢測結(jié)腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性。
　　 3、留取脾臟標(biāo)本置于去RNA酶的冷凍保存管中,經(jīng)液氮冷凍后放于-80℃冰箱,用于realtimequantitativeRT-PCR檢測。
　　 4、留取脾臟標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍后放于-80℃冰箱,用于westernblot檢測。
　　

11、 三、實驗方法及檢測指標(biāo)
　　 1、觀察動物一般狀況、糞便情況及體重改變情況。
　　 2、病理組織學(xué)分析:動物處死后,剖開腹腔,觀察腸管顏色、有無水腫、出血、擴張、潰瘍及粘連,腸系膜淋巴結(jié)腫大情況;結(jié)腸組織蘇木素伊紅染色(hematoxylinandeosinstain,HE)觀察結(jié)腸炎癥的程度和病變的深度,并評分。
　　 3、用化學(xué)方法檢測結(jié)腸組織MPO的活性。
　　 4、用免疫組化法檢測結(jié)腸組織TNF

12、α蛋白,IL-10蛋白表達(dá)情況。
　　 5、用realtimequantitativeRT-PCR檢測脾臟T-betmRNA,Foxp3mRNA表達(dá)情況。
　　 6、用WesternBlot檢測脾臟T-bet蛋白,Foxp3蛋白表達(dá)情況。
　　 四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 計量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示,計量資料差異比較用t檢驗,計數(shù)資料用X2檢驗,用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,P＜0.05

13、為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 一、小鼠的一般情況
　　 (一)小鼠用TNBS乙醇灌腸后,在第2天即出現(xiàn)精神萎靡、體毛凌亂并缺乏光澤、懶動、厭食、排粘液稀便,這些表現(xiàn)逐漸加重,從第3天開始出現(xiàn)肉眼血便,體重下降等癥狀,造模成功,同時出現(xiàn)小鼠死亡,第4天后小鼠狀態(tài)好轉(zhuǎn),死亡減少,體重逐漸恢復(fù)。第7天總存活率為68%,其中丹參治療D組存活率較高為91%,與A組存活率50%比較差異具有顯著性,B組存活率為64%

14、,與A組存活率比較差異無顯著性。
　　 (二)小鼠DAI記分
　　 小鼠DAI記分在丹參治療組降低,第8天丹參治療組D組和E組DAI記分為2.67±0.58和2.33±0.58,與A組4.00±0.00相比差異具有顯著性:第15天丹參治療組D組和E組DAI記分為0.33±0.58和0.00±0.00,與A組1.67±0.58相比差異具有顯著性。
　　 二、小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)改變
　　 (一)大體觀察

15、>　　 小鼠病變部位以結(jié)腸為主,遠(yuǎn)端結(jié)腸壁增厚,近端結(jié)腸擴張,腸壁、腹膜和大網(wǎng)膜之間有粘連,重癥小鼠部分或全結(jié)腸出現(xiàn)充血,水腫,嚴(yán)重的發(fā)生壞死,造成死亡。腸系膜淋巴結(jié)普遍腫大。腸粘膜病變表現(xiàn)有不同程度的水腫、糜爛和潰瘍。結(jié)腸病變在第8天較重,第15天部分好轉(zhuǎn),而腸系膜淋巴結(jié)持續(xù)腫大。以上病變在丹參治療組C組、D組和E組普遍減輕。
　　 (二)光學(xué)顯微鏡鏡下觀察
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織,第8天可見上皮細(xì)胞壞死

16、脫落,粘膜糜爛、充血、出血、粘膜固有層大量炎性細(xì)胞浸潤,局部有隱窩膿腫、潰瘍形成,粘膜腺體排列紊亂、破壞、消失,杯狀細(xì)胞減少甚至消失,腸壁增厚,以上病變在丹參治療組明顯減輕,其中粘膜固有層炎性細(xì)胞浸潤在丹參治療組C組、D組和E組分別為482±54、397±41和383±50,與A組560±88相比差異具有顯著性,組織學(xué)損傷評分分別為4.56±1.53、3.22±0.97和2.78±0.44,與A組5.33±0.50相比差異具有顯著性,在

17、第15天各組病變部分減輕,但丹參治療D、E組與A組相比差異仍具有顯著性。
　　 三、小鼠結(jié)腸組織MPO檢測
　　 TNBS造模第8天,各組小鼠結(jié)腸MPO活性都升高,其中A、B組升高明顯,為3.80±0.39、3.84±0.35,丹參治療組C組、D組和E組分別為3.16±0.32、2.65±0.24和1.91±0.24,與A組比較差異都有顯著性;第15天丹參治療各組MPO活性都有不同程度下降,分別為2.29±0.29、1.

18、78±0.13和1.51±0.18,而A、B組下降不明顯,丹參治療各組與A組比較差異都具有顯著性。
　　 四、結(jié)腸組織TNFα,IL-10表達(dá)情況
　　 (一)TNBS造模第8天用免疫組化法檢測結(jié)腸組織TNFα的表達(dá)情況,表明TNFα平均光密度值在各組都有不同程度的升高,而丹參治療組D組和E組分別為(21.39±4.65)*10-3和(19.39±6.54)*10-3,與A組(29.28±4.70)*10-3比較差異具有

19、顯著性:第15天各組TNFα平均光密度值都有不同程度下降,各組比較差異都不具有顯著性。
　　 (二)TNBS造模第8天用免疫組化法檢測結(jié)腸組織IL-10的表達(dá)情況,表明IL-10平均光密度值在各組都有不同程度的升高,而丹參治療組C組、D組和E組分別為(20.29±3.26)*10-3、(19.19±3.13)*10-3和(17.63±10.89)*10-3,與A組(47.36±2.79)*10-3比較差異都具有顯著性;第15天各

20、組IL-10平均光密度值都有不同程度下降,各組比較差異都不具有顯著性。
　　 五、脾臟T-betmRNA,T-bet蛋白表達(dá)情況
　　 TNBS造模第8天小鼠脾臟組織T-betmRNA表達(dá)在各組都有不同程度的升高,丹參治療組C組、D組和E組分別為1.64±0.04、1.46±0.09和1.25±0.11,與A組2.13±0.06比較差異都具有顯著性;第15天各組T-betmRNA都有不同程度下降,但丹參治療組C組、D組和

21、E組與A組比較差異仍都具有顯著性。小鼠脾臟組織T-bet蛋白表達(dá)在各組都有不同程度的升高,其中A組和B組明顯升高,丹參治療組隨丹參濃度增加依次減低,與T-betmRNA表達(dá)趨勢一致。
　　 六、脾臟Foxp3mRNA,Foxp3蛋白表達(dá)情況
　　 TNBS造模第8天小鼠脾臟組織Foxp3mRNA表達(dá)在各組都有不同程度的升高,丹參治療組升高明顯,C組、D組和E組分別為1.75±0.05、1.96±0.06和2.05±0.0

22、7,與A組1.57±0.07比較差異都具有顯著性;第15天各組Foxp3mRNA都有不同程度下降,但丹參治療組C組、D組和E組與A組比較差異仍都具有顯著性。小鼠脾臟組織Foxp3蛋白表達(dá)在各組都有不同程度的升高,其中丹參治療組升高明顯,并隨丹參濃度增加依次增高,與Foxp3mRNA表達(dá)趨勢一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、丹參可以減輕TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病的腸道炎癥損傷,促進(jìn)腸道粘膜修復(fù),提高TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病