NGF對表達(dá)突變型APP的PC12細(xì)胞作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 阿爾茨海默病(AD)是常見的老年人慢性退行性神經(jīng)疾病，AD的主要病理學(xué)標(biāo)志包括老年斑(SP)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)。SP的淀粉樣沉積物主要成份是β-淀粉樣肽(Aβ-包括Aβ<,40>和Aβ<,42>)，由淀粉樣前體蛋白(APP)分解而來，被認(rèn)為在AD的發(fā)病中起著十分重要的作用。目前許多證據(jù)表明，APP基因的點(diǎn)突變、代謝異常及過表達(dá)所引起的Aβ聚集，是AD發(fā)病的重要原因之一。越來越多的研究證實(shí)AD存在多基因缺陷，包括

2、APP、PS1、PS2、apoE4、ACT以及ERAB基因，且建立了許多AD轉(zhuǎn)基因動物模型。然而，受不同內(nèi)外環(huán)境的影響及不同的實(shí)驗(yàn)條件限制，不便于系統(tǒng)探討AD特征性標(biāo)志產(chǎn)物APP及Aβ的表達(dá)及其對細(xì)胞的影響。目前，國外對AD病的致病機(jī)制的研究主要集中在轉(zhuǎn)基因動物模型上，國內(nèi)尚無通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因AD細(xì)胞模型并使用NGF進(jìn)行干預(yù)的報道。本研究旨在構(gòu)建突變型APP基因序列的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，觀察APP及Aβ的表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞

3、周期的改變，并使用神經(jīng)生長因子(NGF)進(jìn)行干預(yù)，系統(tǒng)探討AD重要致病因素APP及Aβ表達(dá)的分子機(jī)制及NGF對AD的治療作用。 方法： 1.質(zhì)粒構(gòu)建：NCBI網(wǎng)站上查找APP基因及其啟動子的序列，分析其區(qū)域，設(shè)計引物，以人胎腦組織cDNA作模板擴(kuò)增APP序列，同時采用over-lap PCR方法擴(kuò)增突變型APP基因，將突變型APP基因與綠色熒光蛋白基因(GFP)融合后構(gòu)建成真核表達(dá)載體Tmu-APP-GFP，并測序證實(shí)。

4、 2．PCI2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Tmu-APP-GFP真核表達(dá)載體后，APP及Aβ的表達(dá)以及細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞周期的變化：將Tmu-APP-GFP質(zhì)粒DNA進(jìn)行大量抽提并進(jìn)行PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染，RT-PCR檢測細(xì)胞中mRNA的表達(dá)，并在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h三個時間點(diǎn)進(jìn)行Ap的放免測定，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 3．NGF對PCI2細(xì)胞作用研究：將PCI2細(xì)胞按轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染，加用與不加用NGF培養(yǎng)液以及加用NGF培養(yǎng)液的先后順序分為

5、NGF／APP組、APP組、APP／NGF組、NGF組以及PCI2組共5組。分別進(jìn)行RT-PCR檢測PCI2細(xì)胞中APP mRNA表達(dá)、Ap的放免測定及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果： 1．突變型APP基因和GFP基因融合后的真核表達(dá)載體經(jīng)酶切檢測及測序分析證實(shí)構(gòu)建成功。 2．經(jīng)RT-PCR檢測，轉(zhuǎn)染后PCI2細(xì)胞．APP產(chǎn)量明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；經(jīng)放免測定的Ap含量在24h、48h、72h三個時間點(diǎn)，轉(zhuǎn)染組

6、較非轉(zhuǎn)染組均有明顯的提高；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染組處于Go期的細(xì)胞明顯增多，而進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，增值指數(shù)(PI)明顯降低。 3．經(jīng)RT-PCR檢測，5組中轉(zhuǎn)染突變型．APP質(zhì)粒的NGF／APP、APP、APP／NGF組細(xì)胞中APP產(chǎn)量明顯高于NGF和PCI2組；經(jīng)放免測定的Aβ含量在24h、48h、72h三個時問點(diǎn)，NGF／APP、NGF、PCI2組較APP、APP／NGF組明顯減少，有顯著差異性；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，

7、與正常對照PCI2組相比,NGF／APP組細(xì)胞在Go期明顯增多，而進(jìn)入S期的減少；但相比APP組，NGF／APP組細(xì)胞在Go期的明顯減少，而進(jìn)入S期的細(xì)胞增多。PI值在NGF／APP組與NGF、PCI2組之間有極顯著差異，與APP組和APP／NGF組也有顯著差異。 結(jié)論： 1、突變型．AD細(xì)胞模型是用于APP異常代謝途徑，AD發(fā)病分子和細(xì)胞水平機(jī)制，藥物篩選及藥物的作用機(jī)制研究的重要工具。 2、APP基因突變是導(dǎo)