G-CSF及褪黑素對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究.pdf

1、神經膠質瘤(Glioma)是最常見的中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，約占中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的50％。膠質瘤呈浸潤性生長，惡性程度高，患者預后差，是引起中樞神經系統(tǒng)腫瘤相關性死亡的首要原因。近年來，膠質瘤治療在手術方式、放療、化療、免疫治療以及基因治療等方面有了很大進展，但是膠質瘤仍然不能被治愈，患者中位生存期不超過1年。膠質瘤之所以不能被治愈，主要是因其具有高增殖力和強遷移侵襲性。因此，控制腫瘤細胞的增殖和遷移侵襲是治療膠質瘤的首要目標。然

2、而，現(xiàn)存的治療手段受到藥物神經毒性、血液毒性以及難以透過血腦屏障(Brainbloodbarrier，BBB)等諸多限制，對膠質瘤的治療效果并不理想。因此，亟需開發(fā)新的有效且低毒并容易穿過血腦屏障的治療手段，并且新的治療手段需要對膠質瘤細胞增殖和遷移侵襲的分子機制進行深入的研究。
　　 粒細胞集落刺激因子(Granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)和褪黑素是臨床常用的兩種藥物，均具有神經

3、保護作用，且能透過血腦屏障。G-CSF具有促進骨髓造血的作用，臨床上常用于骨髓抑制造成的粒細胞減少癥，已經成為腫瘤治療中重要的輔助治療手段，但其對腫瘤細胞的作用，尚需進一步探討。有研究報道褪黑素具有抗腫瘤的作用，有望成為膠質瘤的輔助治療手段。
　　 G-CSF是生長因子家族成員，通過與其特異性受體G-CSF受體(G-CSFR)結合發(fā)揮作用，主要功能是刺激骨髓產生粒細胞和干細胞。除了造血系統(tǒng)，G-CSF還可以作用于神經系統(tǒng)，尤其在

4、腦缺血等疾病狀態(tài)下，G-CSFR在神經元中表達，被G-CSF激活后能夠阻止神經元凋亡。G-CSF也可以促進神經干細胞(Neuralstemcells，NSCs)的增殖和分化。這些現(xiàn)象都說明G-CSF在神經源性細胞的生長和維持方面發(fā)揮著重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF與G-CSFR與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。造血干細胞中G-CSF信號通路持續(xù)過度激活可導致血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生。同時研究也發(fā)現(xiàn)G-CSF與G-CSFR在多種腫瘤中表達，如黑

5、色素瘤、肺小細胞癌、膀胱癌、前列腺癌及腦腫瘤等，并能促進腫瘤細胞的增殖與侵襲。但是目前G-CSF在人腦膠質瘤中的作用與作用機制尚不清楚。
　　 褪黑素(Melatonin)是由松果體(Pineal)、視交叉上核(Suprachiasmaticnucleus)及周圍組織合成分泌的一種神經內分泌激素，具有抗氧化作用，在神經退行性疾病，如阿爾茲海默病(Alzheimer'sdisease，AD)和帕金森氏病(Parkinson'sdi

6、sease，PD)及腦缺血性疾病中保護神經元免受自由基損傷。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素還具有抗腫瘤作用，能夠抑制包括前列腺癌、結直腸癌、肝癌，黑色素瘤、卵巢癌及乳腺癌在內的多種腫瘤生長。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌細胞株MCF-7中，褪黑素通過提高E鈣粘蛋白和β1整合素水平、調節(jié)微絲的排列及降低基質金屬蛋白酶(MMPs)的產生抑制腫瘤細胞侵襲。有研究報道一定濃度的褪黑素能夠阻止膠質瘤細胞從G1期進入S期從而抑制細胞增殖。但是，褪黑素對膠質瘤細胞增殖、

7、遷移和侵襲的影響及機制仍不明確。
　　 本課題包含兩部分，分別研究G-CSF及褪黑素對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其機制，以期為膠質瘤的治療提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　 一、G-CSF對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究
　　 1.G-CSF和G-CSFR在膠質瘤中的表達及與膠質瘤惡性程度的關系
　　 為了檢測G-CSF和G-CSFR在膠質瘤中的表達，我們收集了29例人腦膠質瘤標本，

8、所有標本均依據(jù)2007年世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization，WHO)中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類標準進行病理診斷并分級。其中WHOⅠ/Ⅱ級膠質瘤8例，Ⅲ級間變性膠質瘤9例，Ⅳ級膠質母細胞瘤12例。同時我們也收集了5例顱腦外傷病人行減壓手術切除的腦組織作為正常對照。所有標本均提取總RNA和總蛋白，并制作冰凍切片，利用RT-PCR、Westernblot及免疫組織化學方法分別從mRNA和蛋白水平檢測G-CSF和G-CSFR

9、的表達。RT-PCR結果顯示G-CSF和G-CSFRmRNA在四種級別的膠質瘤中均有表達;Westernblot和免疫組織化學結果顯示G-CSFR蛋白在四種級別膠質瘤中也均能檢測到。其中G-CSF和G-CSFR在7例Ⅰ/Ⅱ級，8例Ⅲ級和12例Ⅳ級膠質瘤中共表達。G-CSF和G-CSFR在四種級別膠質瘤中的表達水平差異不具有顯著性。在作為正常對照的5例腦組織中均未檢測到G-CSF和G-CSFR的表達。
　　 此外，我們還檢測了G-

10、CSF和G-CSFR在原代培養(yǎng)的膠質瘤細胞G0518、膠質瘤細胞系T98G以及原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中的表達。結果顯示G-CSF和G-CSFR在原代培養(yǎng)的膠質瘤細胞G0518和膠質瘤細胞系T98G中均有表達，而在原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中則未檢測到表達。以上結果說明G-CSF與G-CSFR在膠質瘤中高表達。
　　 2.G-CSF對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響
　　 為了研究G-CSF對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響，

11、我們從惡性膠質瘤病人腫瘤組織中分離并培養(yǎng)細胞，構建原代培養(yǎng)膠質瘤細胞G0518，并采用膠質瘤細胞株T98G作為體外模型。利用外源性G-CSF刺激膠質瘤細胞，通過MTT法檢測G-CSF對膠質瘤細胞活力的影響，結果顯示，相對于對照組，G-CSF明顯促進膠質瘤細胞活力，作用呈劑量依賴性，濃度為100ng/ml時促進作用最強。通過BrdU摻入實驗、克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell遷移和侵襲實驗等實驗方法，研究G-CSF對膠質瘤細胞增殖

12、、遷移及侵襲的影響。結果顯示，相對于對照組，外源性G-CSF明顯促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。
　　 3.G-CSF促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的機制
　　 為了研究G-CSF促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的機制，我們首先利用G-CSFR抗體中和G-CSFR，阻斷G-CSF信號通路，結果顯示相對于對照組，G-CSFR抗體明顯抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。這說明G-CSF通過與G-CSFR結合發(fā)揮作用

13、。
　　 有研究報道G-CSF與G-CSFR的結合激活G-CSFR將胞外信號傳到10胞內，后者進一步激活信號轉導與轉錄激活因子3(SignalTransducerandActivatorofTranscription3，STAT3)通路將信號向細胞核內傳導。因此，為了進一步研究G-CSF促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的機制，我們利用Westernblot的方法，檢測G-CSF對STAT3的活化的影響。結果顯示，外源性G-CSF可

14、以激活胞內STAT3，而且這種激活效應呈現(xiàn)出時間依賴性:磷酸化的STAT3(phosphorylatedSTAT3，p-STAT3)水平在G-CSF刺激5min即開始升高，15min達到高峰，1h左右回落至基礎水平;G-CSFR抗體預處理則可以抵消外源性G-CSF對STAT3的激活效應。以上結果表明，G-CSF參與STAT3活化的調節(jié)。
　　 為了進一步研究STAT3通路活化與G-CSF在膠質瘤中作用的關系，我們利用實時定量PC

15、R檢測了外源性G-CSF和G-CSFR抗體對STAT3下游與增殖、凋亡、侵襲及血管形成相關靶分子基因表達的影響。結果顯示外源性G-CSF促進STAT3下游靶分子Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2associatedXprotein，Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcelllymphoma/leukimia2，Bcl-2)、血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、基質金屬蛋白酶2(

16、matrixmetalloproteinase2，MMP2)及MMP9的基因表達;G-CSFR抗體則抑制這些分子的表達，并引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比值升高。這些結果提示STAT3信號通路參與G-CSF對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的調節(jié)。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)G-CSF與G-CSFR在膠質瘤中過度表達，不同級別的膠質瘤中表達無顯著性差異。G-CSF促進膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲，提示G-CSF可能參與膠質瘤的惡性進展。G-C

17、SFR抗體抑制膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲，提示G-CSFR可能是潛在的治療靶點。G-CSF激活STAT3促進其下游與增殖、凋亡、侵襲及血管形成相關的靶分子基因的表達，提示STAT3信號通路參與介導G-CSF對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲的調節(jié)。
　　 二、褪黑素對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究
　　 1.褪黑素對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　 我們首先利用MTT法檢測不同濃度褪黑素對膠質瘤細胞活

18、力的影響。結果顯示，無論1nM生理濃度還是1mM藥理濃度的褪黑素處理24h均不影響膠質瘤細胞活力。臺盼藍拒染法結果顯示，生理濃度和藥理濃度的褪黑素對膠質瘤細胞存活無明顯影響。然后，我們利用劃痕試驗和Transwell細胞侵襲實驗檢測褪黑素對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響，結果顯示，1mM褪黑素明顯抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲，1nM褪黑素則無此作用。以上結果說明褪黑素抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲，不影響膠質瘤的增殖能力。
　　 2.褪黑素

19、抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究
　　 為研究褪黑素抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的機制，我們首先利用實時定量PCR檢測了褪黑素對膠質瘤細胞MMP2和MMP9表達的影響，結果顯示，1mM褪黑素明顯抑制膠質瘤細胞MMP2和MMP9的表達。上述結果提示，褪黑素可能通過抑制MMPs表達來抑制膠質瘤細胞侵襲。
　　 褪黑素是自由基清除劑，通過對膠質瘤細胞內ROS的檢測，我們發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下，膠質瘤細胞能產生一定量的RO

20、S，褪黑素處理后，膠質瘤細胞內ROS水平降低。上述結果表明褪黑素處理改變了膠質瘤細胞氧化應激狀態(tài)，提示其可能對氧化應激通路產生影響。NF-κB是氧化應激通路重要的節(jié)點分子，受ROS調控，并能調節(jié)MMPs表達，因此，我們檢測了NF-κB活化情況。Westernblot結果顯示NF-κB在正常培養(yǎng)條件下的膠質瘤細胞內持續(xù)活化，褪黑素可降低其活化水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB活化抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(Pyrrolidinedithio

21、carbamate，PDTC)抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲及MMP2和MMP9表達，且不影響膠質瘤細胞活力，與褪黑素作用相似。以上結果提示氧化應激通路參與褪黑素對膠質瘤細胞遷移和侵襲的調節(jié)。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)1mM褪黑素抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲及MMP2和MMP9表達，但不影響膠質瘤細胞增殖。1mM褪黑素降低膠質瘤細胞內活性氧(ROS)水平并抑制NF-κB激活。NF-κB活化抑制劑在膠質瘤增殖、遷移和侵襲中的作用與褪黑素相