Cavl不同表達對U87膠質(zhì)瘤細胞的影響以及細胞外ATP對U87膠質(zhì)瘤侵襲和遷移研究.pdf

1、一、研究背景及目的：
　　 膠質(zhì)瘤(glioma)是人顱內(nèi)最常見的腫瘤，其生物學(xué)特性中最重要的特點是腫瘤細胞侵入到正常腦組織，圍繞在原發(fā)灶周圍形成所謂的“衛(wèi)星腫瘤灶”，而且常要侵襲腦的重要功能區(qū)，由于沒有合理的切實可行的辨認腫瘤邊界的方法或者技術(shù)，因此一直以來手術(shù)切除腫瘤的程度很有限，而且術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的幾率隨著病理級別的升高而升高，更為可怕的是人腦膠質(zhì)瘤中的大約50%左右是膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma)，它們的特性是侵

2、襲性強、復(fù)發(fā)時間短、預(yù)后差?，F(xiàn)代計算機斷層掃描、術(shù)前MRI(核磁共振)等影像技術(shù)仍難以準確的確定腫瘤邊界，即使術(shù)中使用了普通顯微鏡，但是放大倍數(shù)還很有限，仍然難以辨認腫瘤界限，而且殘留的腫瘤細胞即使僅占1mm3體積細胞數(shù)目將達到109個，因此，研究膠質(zhì)瘤侵襲性生長的機制對于臨床治療膠質(zhì)瘤患者有著重要的意義。
　　 Caveolin-1(Cav1)是細胞膜脂質(zhì)微區(qū)上的一種膜蛋白，又稱小窩蛋白，主要作用就是保持膜脂質(zhì)微區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的

3、完整，在人體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞內(nèi)吞、膜脂調(diào)節(jié)、脂肪轉(zhuǎn)運及膽固醇代謝平衡等方面具有重要作用。近年來，Cav1在各種腫瘤的影響越來越被重視，但是它是促進還是抑制腫瘤生長仍存在很多矛盾。我們課題組前期免疫組化檢測也發(fā)現(xiàn)Ⅳ級膠質(zhì)瘤中Cav1高表達，而且發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中Cav1 mRNA水平與膠質(zhì)瘤級別和Ki67陽性細胞數(shù)量呈正相關(guān)。
　　 ATP作為人體重要的能量與代謝物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ATP及其受體構(gòu)成的信號通路還參與了膠質(zhì)細胞細胞的增生

4、、遷移、分化及神經(jīng)元之間的相互作用過程。近來研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞對細胞外ATP的降解速度遠低于膠質(zhì)細胞(9)，膠質(zhì)瘤細胞在生長過程中對膠質(zhì)細胞的毒性作用和破壞也可導(dǎo)致ATP釋放，因此膠質(zhì)瘤細胞所處的微環(huán)境中ATP的濃度升高；而ATP可通過激活其P2Y2受體活化G12和G0，從而促進RhoA-Rock-MLC磷酸化，誘導(dǎo)應(yīng)力纖維形成和細胞的侵襲，但是這個過程需要P2Y2受體與αv整合素結(jié)合，若阻斷P2Y2受體與αv整合素的結(jié)合可完全抑制膠質(zhì)

5、瘤細胞的侵襲，但影響P2Y2受體與αv整合素結(jié)合的因素并不清楚。前期的研究已經(jīng)明確，整合素與多種G蛋白耦聯(lián)受體在細胞膜上主要分布于富含Cav1的脂質(zhì)微區(qū)中，與Cav1相互結(jié)合形成復(fù)合體參與多種功能，因此研究ATP對膠質(zhì)瘤的作用，以及其中Cav1的作用，可能在治療膠質(zhì)瘤上有重要的意義。
　　 本課題旨在探討惡性膠質(zhì)瘤侵襲機制的宏觀層面為出發(fā)點，研究了Cav1(Caveolin-1)、細胞外三磷酸腺苷(Adenosine Triph

6、osphate，ATP)在腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長和遷移中的作用。分析了Cav1不同表達在U87膠質(zhì)瘤中生長和侵襲差異，從而為進一步研究腦膠質(zhì)瘤治療提供新的思路與策略，本研究還運用時間顯微鏡成像技術(shù)，能直觀的反映出外界因素作用于U87膠質(zhì)瘤細胞定向遷移現(xiàn)象，而且用蛋白芯片技術(shù)探討了細胞外ATP作用下，細胞蛋白表達情況，為進一步深入研究打下基礎(chǔ)。
　　 二、材料以及研究方法：
　　 (1)用免疫組化技術(shù)檢測U87人腦膠質(zhì)瘤細胞中

7、Cav1是否為陽性表達；
　　 (2)構(gòu)建Cav1慢病毒顆粒來上調(diào)或下調(diào)U87腦膠質(zhì)瘤細胞中Cav1的表達；
　　 (3)應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測Cav1過表達及干擾對U87膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響，并且應(yīng)用MTT法檢測U87人膠質(zhì)瘤細胞的生長曲線；
　　 (4)采用細胞“劃痕”愈合實驗和Transwell侵襲實驗方法分析Cav1上調(diào)或者下調(diào)表達后，U87腦膠質(zhì)瘤細胞的體外遷移和侵襲能力。
　　 (5)細胞外AT

8、P對U87膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響，用CCK-8檢測試劑盒分別檢測了0.1%、1％、10%血清中各濃度梯度ATP作用下對U87腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖情況。
　　 (6)細胞外ATP對U87膠質(zhì)瘤細胞周期的影響，實驗采用流式細胞技術(shù)檢測了不同培養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后U87人腦膠質(zhì)瘤細胞的生長周期。
　　 (7)細胞外ATP對U87細胞體外侵襲的影響，實驗采用Transwell侵襲實驗，以相同條件下不加ATP作為對照組，以加入100

9、μmol/LATP作為處理組，經(jīng)過24h培養(yǎng)并處理小室，對跨膜細胞計數(shù)。
　　 (8)細胞外ATP對U87細胞遷移速度的影響，實驗采用時間顯微鏡每隔2分鐘采集照片1次，其恒溫系統(tǒng)也可以很好的保持細胞活性，觀察細胞外ATP作用下對U87膠質(zhì)瘤細胞遷移的影響。
　　 (9)細胞外ATP作用于U87人腦膠質(zhì)瘤細胞相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平，運用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，分析了100μM ATP的10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基作用于體外培

10、養(yǎng)的U87腦膠質(zhì)瘤細胞45 min后細胞運動相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平變化。
　　 三、主要研究結(jié)果：
　　 1.Cav1過表達及干擾對U87膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲的影響
　　 (1)U87膠質(zhì)瘤細胞中，Cav1呈陽性表達。
　　 (2)成功構(gòu)建出U87膠質(zhì)瘤細胞Cav1過表達及干擾序列。
　　 (3)Cav1過表達及干擾對U87膠質(zhì)瘤細胞增殖無顯著影響。
　　 (4)劃痕試驗表明，U87細胞在

11、含10% FBS DMEM的作用下行劃痕實驗，Cav1干擾表達后，U87膠質(zhì)瘤細胞遷移力明顯強于U87細胞Cav1過表達后；可是在用含有0.1% FBS培養(yǎng)基中Cav1過表達遷移力強于Cav1干擾表達。這說明Cav1對腦膠質(zhì)瘤的遷移能力的作用受外界培養(yǎng)環(huán)境的影響。
　　 (5)Transwell實驗時，在含有10% FBS培養(yǎng)基中Cav1干擾表達后，U87腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲力增強，而過表達Cav1后，U87腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲力呈下降

12、(圖3)；但在含有0.1% FBS培養(yǎng)基下Cav1干擾表達后，U87膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力卻呈降低趨勢，而Cav1過表達中，U87膠質(zhì)瘤細胞侵襲力增強。這說明Cav1對腦膠質(zhì)瘤的侵襲能力的作用受外界環(huán)境的影響。
　　 2、細胞外ATP對U87膠質(zhì)瘤的作用
　　 (1)CCK-8檢測試劑盒分別檢測了0.1%、1%、10%血清中各濃度梯度ATP作用下對U87腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞外較低濃度ATP(100μM、20

13、0μM、500μM)對體外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細胞的增殖無顯著影響，但較高濃度ATP(5000μM)對細胞呈顯著抑制作用。
　　 (2)細胞外ATP對U87膠質(zhì)瘤細胞周期的影響，采用流式細胞技術(shù)檢測了不同培養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后U87人腦膠質(zhì)瘤細胞的生長周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組(100μMATP)及對照組對U87腦膠質(zhì)瘤細胞的生長周期無明顯影響。
　　 (3)細胞外ATP對U87細胞體外侵襲的影響，采用Transwell侵襲

14、實驗，表明一定濃度ATP可以顯著增強U87膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。
　　 (4)細胞外ATP對U87細胞遷移速度的影響情況，實驗采用時間顯微鏡每隔2分鐘采集照片1次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中，100μmol/L的ATP可以顯著增強U87膠質(zhì)瘤細胞的運動能力，使其遷移增強。
　　 (5)細胞外ATP作用于U87人腦膠質(zhì)瘤細胞相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平，實驗采用蛋白質(zhì)芯片分析了與細胞運動相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化水平。100μM細胞外ATP作用于體

15、外培養(yǎng)的U87腦膠質(zhì)瘤細胞45min后VASP(Ab-238)和Rac1/cdc42(Ab-71)信號通路活化
　　 四、結(jié)論
　　 本課題研究了Cav1在U87腦膠質(zhì)瘤細胞生長和侵襲中的作用；以及細胞外ATP對U87人膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲、遷移的作用；建立了細胞外ATP作用下直觀觀察細胞運動的系列裝置，觀察了細胞外ATP對體外培養(yǎng)的U87腦膠質(zhì)瘤細胞遷移的影響。結(jié)論如下：
　　 Cav1在高級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

16、顯著增高，Cav1的表達越高，病人的預(yù)后越差；Cav1對U87人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖無任何作用。
　　 2、Cav1在U87人腦膠質(zhì)瘤細胞增中呈陽性表達，對U87人腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移中的作用具有細胞差異并受腫瘤細胞生長環(huán)境的影響。在細胞外營養(yǎng)充足時，Cav1過表達抑制U87膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。在營養(yǎng)相對缺少的情況下，Cav1過表達增強U87膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。
　　 3、細胞外較低濃度ATP(100μM、200μM、50

17、0μM)對體外培養(yǎng)的U87膠質(zhì)瘤細胞的增殖無顯著影響，但較高濃度ATP(5000μM)對細胞呈顯著抑制作用。
　　 4、細胞外ATP(100μM)可以顯著增強U87膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。
　　 5、運用時間顯微鏡及觀察裝置，可以直觀看出細胞外一定濃度ATP(100μM)可以增強U87膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。
　　 6、蛋白芯片技術(shù)表明ATP作用于U87膠質(zhì)瘤細胞可以顯著增強VASP(Ab-238)和Rac1/cdc

18、42(Ab-71)信號通路活化。
　　 有研究指出膠質(zhì)瘤細胞對細胞外ATP的降解速度遠低于膠質(zhì)細胞，且膠質(zhì)瘤細胞所處的微環(huán)境中ATP的濃度升高；細胞外ATP濃度升高對正常腦組織有細胞毒性作用，而膠質(zhì)瘤細胞不但耐受性高，而且細胞外的ATP還可促進膠質(zhì)瘤細胞的生長和侵襲。本課題研究探討了Cav1在U87腦膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及表達情況，通過細胞外ATP對U87膠質(zhì)瘤細胞的作用，明確了腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長的機制，蛋白芯片技術(shù)研究為進一步探