水通道蛋白4基因缺失對不同類型腦損傷的影響.pdf

1、研究背景：
　　 水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組介導水分子跨膜轉運的細胞膜蛋白，AQP4被認為是腦內最重要的AQP亞型，主要表達在包繞腦微血管及蛛網膜的星形膠質細胞足突膜上，而在非足突的胞體表面表達較少，與其調節(jié)水平衡的功能一致。已經發(fā)現，腦外傷、腦缺血、腦腫瘤等多種腦損傷病理中，伴隨腦內AQP4表達上調；對AQP4基因敲除動物的研究結果提示，AQP4對血管性腦水腫和細胞性腦水腫的形成均有影響。但是，除了調節(jié)

2、水平衡外，AQP4還影響星形膠質細胞的生長及其他功能，參與非水腫性疾病(如炎癥、興奮性氨基酸毒性等)的病理過程。
　　 腦損傷是高度復雜的病理過程，可誘發(fā)一系列細胞及分子事件。在腦損傷的急性期(數小時到數天)，由于代謝紊亂和興奮性毒性導致神經元損傷；在亞急性期(數天到數周)，主要病變?yōu)檠装Y反應和細胞死亡；在慢性期(數周以后)，主要為組織修復等變化。腦損傷中，小膠質細胞和星形膠質細胞起重要作用。小膠質細胞是腦內重要的炎癥細胞，小膠

3、質細胞激活后對于腦損傷后炎癥反應以及慢性神經功能恢復有重要的影響。腦損傷周邊區(qū)的星形膠質細胞反應性增生，最終導致膠質疤痕的形成，膠質疤痕一方面可以限制病變擴散，但又阻礙神經生長。
　　 腦損傷后繼發(fā)的炎癥是影響病變程度和恢復的主要因素之一，受許多炎癥因子、炎癥介質的調節(jié)。半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs)是一類重要的炎癥介質，在腦缺血、腦外傷等中樞神經系統(tǒng)損傷性疾病發(fā)病中起重要作用。Cys

4、LTs主要通過半胱氨酰白三烯受體(cysteinylleukotrienereceptor，CysLT受體)起作用，該類受體主要包括CysLT1和CysLT2受體兩種亞型。藥理學表明，CysLT1受體參與腦缺血后急性期神經元損傷和慢性期膠質增生過程，可誘導血腦屏障通透性增加而參與缺血后炎癥，并能介導粘附因子等的表達；CysLT2受體介導整體和離體水平缺血性損傷后小膠質細胞的激活和吞噬。
　　 在AQP4基因敲除小鼠，對腦缺血等損

5、失后腦水腫變化有較多研究，但是，對于不同類型腦損傷以及炎癥有什么改變，尚無系統(tǒng)研究，尤其需要闡明腦損傷后炎癥變化特點。由于AQP4基因敲除可影響星形膠質細胞功能，由此造成一些非水腫性變化，本研究主要關注這些方面的變化。
　　 研究目的：
　　 本文采用AQP4基因敲除(AQP4-/-)小鼠，觀察不同類型腦損傷模型中AQP4起的作用，擬做以下4個方面的研究：
　　 1.闡明局灶性腦缺血后腦內炎癥變化特點，觀察缺血損

6、傷后24h和72h炎癥細胞和炎癥相關的半胱氨酰白三烯受體，以及其他損傷變化。
　　 2.闡明局灶性腦缺血慢性損傷過程及慢性期改變，觀察缺血損傷后35天內的生存率變化，神經癥狀以及神經元密度和星形膠質細胞反應性增生的變化。
　　 3.闡明腦冰凍傷后損傷特點，觀察損傷后24h，7天和14天損傷面積和神經元密度等變化，以及小膠質細胞反應和星形膠質細胞的膠質疤痕形成特點。
　　 4.闡明興奮性氨基酸毒性的變化特點，建立N

7、MDA皮層注射模型，觀察損傷后24h的損傷面積和神經元密度以及血腦屏障通透性的的變化。
　　 研究方法：
　　 以線栓法制備左側大腦中動脈阻塞(MCAO)，誘導小鼠局灶性腦缺血模型；以改良的顱骨外冰凍法技術建立不同時間點的冰凍傷模型；以大腦皮層微注射技術，建立NMDA誘導腦興奮性毒性損傷模型。
　　 以冰凍切片甲苯胺藍染色法檢測腦損傷面積；以冰凍切片IgG免疫組織化學檢測法觀察血腦屏障通透性的變化；以冰凍切片免疫

8、熒光組織化學法，觀察存活神經元、小膠質細胞、中性粒細胞和星形膠質細胞的的變化；以Fluoro-JadeB染色法觀察壞死神經元變化；以免疫印跡法觀察局灶性腦缺血損傷急性期半胱氨酰白三烯受體的表達特點；免疫熒光共染色法觀察半胱氨酰白三烯受體在腦內的細胞分布。
　　 研究結果：
　　 1.AQP4缺失加重腦缺血急性損傷及炎癥反應
　　 與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠局灶性缺血損傷后24h和72h，周邊區(qū)的神經元密

9、度缺失程度增加；缺血后24h和72h中心區(qū)中性粒細胞浸潤加重；周邊區(qū)阿米巴樣小膠質細胞活化和增殖增多，但桿狀小膠質細胞的密度減少；同時，在72h周邊區(qū)星形膠質細胞反應性增生和聚集減弱。AQP4-/-小鼠缺血側腦組織在缺血后24h和72h，炎癥介質受體－半胱氨酰白三烯受體(CysLT1和CysLT2受體)蛋白表達增加；在兩種小鼠大腦中，CysLT1和CysLT2受體蛋白細胞定位模式一致，在損傷中心區(qū)都表達于損傷的神經元和中性粒細胞，在周邊

10、區(qū)都表達于活化的小膠質細胞，但都不表達于星形膠質細胞。這些結果提示，AQP4缺失加重急性腦缺血損傷期，加重炎癥反應，該變化可能與AQP4-/-小鼠星形膠質細胞功能減弱，限制炎癥的能力下降有關。
　　 2.AQP4缺失加重腦缺血慢性損傷
　　 與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠局灶性腦缺血損傷后35天內的生存率降低，術后的體重恢復減慢，術后神經癥狀的恢復減輕；加重腦萎縮體積和腦內空洞的形成；并且，抑制損傷周邊區(qū)星形膠質細

11、胞的反應性增生和聚集，減弱膠質疤痕的生成。這些結果提示，AQP4-/-小鼠腦損傷慢性期癥狀加重，可能與腦內膠質疤痕形成功能減弱，不利于局部限制損傷病灶擴展有關。
　　 3.AQP4缺失減輕腦冰凍傷急性損傷但加重后期損傷
　　 與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠冰凍傷24h腦損傷面積和腦表面出血均明顯減輕；但是，14天的損傷面積增加。損傷周邊區(qū)的神經元密度變化與損傷面積類似，與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠損傷周邊區(qū)

12、在24h的存活神經元密度明顯較高，但在7天和14天，則密度明顯降低。同時，AQP4-/-小鼠小膠質細胞數量在急性期并沒有明顯的增加或減少，但是，在損傷7天和14天，較野生型小鼠明顯增加。AQP4-/-小鼠星形膠質細胞密度在7天和14天都明顯減少。結果提示，AQP4基因缺失減輕小鼠腦冰凍傷急性損傷，但是加重延遲性損傷，可能與損傷后期小膠質細胞增生加重有關。
　　 4.AQP4缺失加重興奮性氨基酸誘導的損傷
　　 小鼠皮層注

13、射NMDA150nmol后24h，可導致皮層損傷、神經元變性及血腦屏障通透性增高。與野生型小鼠相比，AQP4-/-小鼠的損傷變化明顯增強。結果提示，AQP4可能抑制NMDA誘導的急性腦損傷，增加損傷區(qū)Fluoro-JadeB陽性的交性神經元密度，并且，與抑制血腦屏障通透性增高有關。結果提示，AQP4在NMDA誘導的腦損傷中可能起保護作用。
　　 結論：
　　 1.在局灶性腦缺血損傷模型中，AQP4基因缺失可加重缺血性腦損

14、傷。缺血急性期小膠質細胞和中性粒細胞聚集增加，誘導炎癥相關的半胱氨酰白三烯受體表達。慢性期加重死亡率，減慢小鼠體重增長，加重腦萎縮體積和腦內空洞形成。這些變化可能與AQP4基因缺失減弱星形膠質細胞細胞增生和聚集，減弱膠質疤痕的生成有關。
　　 2.在腦冰凍傷中，AQP4基因缺失小鼠在早期腦表面出血和腦損傷面積減輕；但后期腦損傷加重，這可能與減弱星形膠質細胞反應性增生，妨礙膠質疤痕生成有關。
　　 3.在興奮性氨基酸損傷模