靶向核酸納米歸巢氣霧裝置的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的：基因治療，特別是最具前景的小分子RNA干擾作為基因藥的治療，選擇合適的載體及導入方法是一個瓶頸，也是核酸為基礎(chǔ)的藥物能否在臨床成功應用的關(guān)鍵。病毒載體因其具有高效轉(zhuǎn)導基因的特點，是目前基因治療臨床研究的主流載體。但隨著時間的推移，病毒載體介導免疫炎癥以及激活原癌基因的潛在危險性等自身無法克服的缺陷已日益顯現(xiàn)。因此，研發(fā)非病毒載體已成為基因治療研究的熱點。
　　 非病毒載體具有低毒、低免疫原性等特點，其中的殼聚糖及

2、其衍生物因具備極高的生物相容性受到科學家們的青睞。我們在前期的研究工作中，已經(jīng)研制出烷基化殼聚糖納米核酸載體，并能成功的將靶目標核酸轉(zhuǎn)入肺的上皮細胞，表達相應蛋白。但存在的缺點是轉(zhuǎn)染效率低。精氨酸中的特征基團胍基能夠促進細胞的內(nèi)吞，具有細胞轉(zhuǎn)導肽的作用，因此，對殼聚糖進行胍基化修飾有望改善原殼聚糖納米載體轉(zhuǎn)染效率低的缺點。同時，β2腎上腺能受體廣泛分布于支氣管平滑肌和肺組織內(nèi)，依據(jù)配體－受體結(jié)合的原理，采納臨床用支氣管舒張劑－β2受體興

3、奮劑作為歸巢裝置，把沙丁胺醇接枝于胍基化的殼聚糖上，有望通過靶向性修飾增加其核酸轉(zhuǎn)運的效率與特異性。不僅如此，針對特定靶器官的局部給藥方式具有吸收迅速、起效快、使用方便和副作用小等特點，是呼吸系統(tǒng)疾病治療一種常用有效的給藥途徑。通過探討超聲霧化運送殼聚糖納米核酸藥的給藥方式，最終構(gòu)建一種新型RNA干擾殼聚糖納米載體靶向歸巢氣霧治療裝置，將能極大解決RNA干擾等核酸類藥物在呼吸系統(tǒng)疾病臨床應用的問題。
　　 研究內(nèi)容和方法：

4、>　　 第一部分胍基化殼聚糖的物化性質(zhì)和基因轉(zhuǎn)染效率第一節(jié)胍基化殼聚糖物化性質(zhì)的檢測
　　 1.胍基化殼聚糖的合成；
　　 2.透射電鏡觀察Gua-chitosan/DNA的粒徑大小和分布；
　　 3.比較中性水溶液中chitosan和Gua-chitosan之間的溶解性，以及完全溶解狀態(tài)下，兩種載體溶液的PH值；
　　 4.凝膠阻滯實驗觀察兩種載體的核酸結(jié)合能力；
　　 5.利用WES-8比較

5、各種載體的細胞毒性。
　　 第二節(jié)胍基化殼聚糖轉(zhuǎn)染效率的評價與機制探討
　　 1.應用綠色熒光蛋白報告基因載體(Enhanced green fluorescent protein plasmid，pEGFP)轉(zhuǎn)染293細胞，熒光顯微鏡觀察不同殼聚糖納米載體的轉(zhuǎn)染效率，并結(jié)合流式細胞儀進行轉(zhuǎn)染效率的定量分析；
　　 2.流式細胞儀檢測在不同載體的包裹下單個細胞的熒光強度，了解它們對GFP表達影響；
　　

6、3.觀察不同胍基取代度對殼聚糖轉(zhuǎn)染效率的影響；
　　 4.跟蹤不同時間點各種載體轉(zhuǎn)染效率的變化。
　　 5.連接Pet質(zhì)粒和yoyo1熒光染料，觀察各種載體向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運核酸的能力。
　　 6.連接Pet質(zhì)粒和yoyo1熒光染料，觀察各種載體在體轉(zhuǎn)運核酸的能力。
　　 第二部分載體的靶向性改造
　　 1.沙丁胺醇接枝于胍基化的殼聚糖及質(zhì)譜分析。
　　 2．比較Sal-Gua-chitosan

7、和Gua-chitosan在具有β2受體的293細胞及不表達β2受體的16HBE細胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　 第三部分超聲霧化對殼聚糖核酸復合物轉(zhuǎn)染效率的影響及其機理
　　 1.凝膠電泳觀察超聲霧化下，Gua-chitosan對于DNA的保護作用；
　　 2.分別比較載體/DNA復合物經(jīng)超聲霧化以后，pEGFP在293和16HBE細胞當中轉(zhuǎn)染效率的變化；
　　 3.透射電鏡觀察超聲霧化前后，載體和載體/DNA復

8、合物粒徑大小和分布的變化。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分胍基化殼聚糖的物化性質(zhì)和基因轉(zhuǎn)染效率
　　 第一節(jié)胍基化殼聚糖粒徑在20-70nm之間；殼聚糖經(jīng)胍基化修飾以后在中性水溶液當中的溶解性大大增加；胍基能降低殼聚糖自身的電荷密度，造成與DNA結(jié)合的臨界復合比升高；與天然殼聚糖相仿，胍基化改造并沒有增加載體的細胞毒性，兩者對于細胞生長率均沒有明顯影響。
　　 第二節(jié)胍基化殼聚糖轉(zhuǎn)染pEGFP的效率明顯高于

9、天然殼聚糖，這種轉(zhuǎn)染效率的提高在一定范圍內(nèi)并不依賴于胍基化程度的高低。在單個細胞的水平上，胍基化殼聚糖所轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白的強度高于天然殼聚糖。在轉(zhuǎn)染后24小時，脂質(zhì)體所介導的基因表達達到峰值，而胍基化殼聚糖所介導的基因轉(zhuǎn)染，蛋白表達的高峰出現(xiàn)在72小時。細胞體外實驗和在體實驗均顯示，胍基化殼聚糖能更有效的地把質(zhì)粒DNA運送到細胞體內(nèi)。
　　 第二部分載體的靶向性改造
　　 與不表達β2受體的16HBE細胞比較，293細

10、胞用Sal-胍基化殼聚糖納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光報告質(zhì)粒的表達效率顯著高于未引入配體的胍基化殼聚糖納米載體。
　　 第三部分超聲霧化對殼聚糖核酸復合物轉(zhuǎn)染效率的影響及其機理
　　 殼聚糖能有效保護被包裹的DNA免受超聲振蕩的剪切作用。殼聚糖/DNA復合物經(jīng)超聲霧化以后轉(zhuǎn)染效率顯著提高。超聲處理后復合物粒徑分布范圍較前變窄，粒徑增大，顆粒均勻度較前明顯改善。
　　 結(jié)論：
　　 1.胍基化修飾的殼聚糖納米載體能

11、有效提高核酸的運送及轉(zhuǎn)染效率，在生理PH值環(huán)境下能夠溶于水，為臨床局部應用的可行性奠定了基礎(chǔ)。胍基化修飾的殼聚糖納米提高轉(zhuǎn)染效率的機制可能是通過提高細胞的內(nèi)吞作用實現(xiàn)，。該特質(zhì)性更有利于其在體轉(zhuǎn)送核酸物質(zhì)。
　　 2.Β2受體興奮劑－沙丁胺醇接枝的胍基化殼聚糖納米載體通過引入靶向歸巢裝置，能夠利用氣道細胞存在大量β2受體的特點，依據(jù)配體－受體結(jié)合的基本原理，進一步提高細胞對核酸的攝取與轉(zhuǎn)染效率，為在體經(jīng)氣道局部給予核酸類藥奠定了