白體骨髓間充質干細胞治療下肢缺血性疾病研究.pdf

1、本研究旨在通過分析移植自體MSCs前后下肢血流灌注情況，探索其安全性、可行性，并且取得了初步結果。研究內容分為兩部分： 第一部分：基礎研究。 1.研究方法： ①健康純種新西蘭大白兔26只，雌雄不限，按移植成分的不同，隨機分成3組：(1)移植轉染VEGF的MSCs組10只(以下簡稱VEGF組)；(2)移植單純MSCs組8只(以下簡稱MSCs組)；(3)移植DMEM(Dulbeco’sModifiedEagleMed

2、ium，DMEM)液組8只(以下簡稱DMEM組)。 ②抽取骨髓，進行MSCs的體外培養(yǎng)增殖，當細胞數(shù)達107后制成單細胞懸液供移植或轉染用。 ③用含hVEGF165的非擴增型腺病毒轉染MSCs，細胞轉染2天后用胰蛋白酶處理制成107/ml的細胞懸液供移植用。轉染后hVEGF165的表達用RT-PCR法和Westernblot方法鑒定。同時取部分MSCs轉染GFP(greenfluorescenceprotein，GFP)

3、以熒光顯微鏡測定其轉染率。 ④缺血后肢動物模型的建立：經(jīng)腹腔注射麻醉后，將右股動脈從髂外動脈分出的起始部至腘動脈處結扎切除，30min后在股部肌肉取5點按實驗分組分別植入無細胞的DMEM液、單純傳代培養(yǎng)的MSCs、轉染hVEGF165的MSCs。 ⑤術后每周(共4周)行ECT檢測后肢血流灌注，以ECT體內標記紅細胞法動態(tài)測定兔缺血后肢血流灌注，取右/左后肢比值進行數(shù)據(jù)分析。 ⑥統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以x±S表示，組間比

4、較采用spss11.5軟件進行方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。 2.研究結果： ①MSCs轉染hVEGF165及GFP后未見細胞死亡，轉染率達95％以上，各移植組細胞懸液MSCs計數(shù)均在107以上。 ②到移植后4周，各組分別存活動物為VEGF組8只，MSCs組6只，DMEM組5只。 ③RT-PCR法：轉染hVEGF165的MSCs組在150bp處有片段表達，而轉染GFP的MSCs組及未轉染的MSC

5、s組無片段表達。Westernblot法：轉染hVEGF165的MSCs組在23KD處有目的條帶，而轉染GFP的MSCs組及未轉染的MSCs組無條帶表達。 ④術后各周的均數(shù)差異，VEGF組與DMEM組在術后1、3、4周P＜0.05，MSCs組與DMEM組在術后2、3周P＜0.05。 3.研究結論： MSCs培養(yǎng)及轉染VEGF后移植治療下肢缺血是安全可行的，本實驗結果表明自體MSCs移植可以有效改善缺血下肢的血流灌

6、注，但轉染VEGF似乎并不能進一步提高MSCs改善缺血下肢血流灌注的效果。 第二部分：臨床研究： 1.研究方法： ①將下肢缺血患者經(jīng)動脈造影證實小腿動脈流出道不佳者作為入選對象，本組共13例。 ②髂骨處抽取自體骨髓培養(yǎng)，細胞數(shù)達107時制成單細胞懸液移植，同時取部分細胞以流式細胞儀測定其表面抗原CD117，CD29，CD166，CD45，CD34表達。 ③移植途徑：a.經(jīng)DSA/B超引導下經(jīng)股/腘

7、動脈內移植；b.肌肉注射移植。 ④所有患者均被隨訪，時間為1～14個月，平均5個月。 2.研究結果： ①MSCs培養(yǎng)1例失敗，后經(jīng)骨髓檢查證實為粒系增生低下，培養(yǎng)成功12例。12例患者流式細胞儀測定其表面抗原CD117，CD29，CD166，CD45，CD34平均值各為40.7，74.7，38.6，48.4，1.90，證實為MSCs。 ②在13例共20條足部疼痛中，緩解率為80％；10條伴有小腿疼痛的下肢