新肝癌相關基因HTA功能的初步研究.pdf

1、目的：肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是發(fā)病率高、惡性程度高、預后差的惡性腫瘤，其發(fā)病機制涉及多基因調(diào)控、多信號通路參與，是一個復雜的網(wǎng)絡體系，其根源是基因表達異常。肝癌的傳統(tǒng)治療效果不理想，免疫治療和基因治療現(xiàn)已成為研究熱點，在肝癌中異常表達的基因是其理論基礎的核心。發(fā)現(xiàn)和研究新的具有應用前景的腫瘤相關基因仍是腫瘤研究的重要領域和難題。聚焦于肝癌相關基因的研究有望為肝癌的早期診斷、分子免疫治療及預后分析

2、提供有力的工具。對肝癌相關基因功能機制的深入研究不僅能豐富肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制和理論體系，更重要的是為肝癌的臨床診斷和治療提供有力的標志物和靶點。HTA基因是本實驗室通過生物信息學方法篩選得到的新肝癌相關基因，前期實驗結果表明HTA基因不僅是一種特異性較強的腫瘤標志物，而且在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進作用，故有望將其應用于肝癌的診斷和免疫治療。同時，正因為HTA基因是從EST文庫中新篩選發(fā)現(xiàn)的肝癌相關基因，前期研究只對其表達的特異性和促癌

3、作用有了初步認識，但是關于該基因結構和功能機制方面的研究尚未開展，因此，本課題擬通過RACE和Northern blot等方法克隆HTA基因的全長并對其進行結構分析，對HTA基因編碼的蛋白進行表達、純化并制備單抗，用過表達手段研究HTA基因在肝癌細胞系的中的功能，并結合基因芯片、酵母雙雜交、western blot等多種細胞生物學、分子生物學、生物信息學、實驗動物學等研究手段和策略深入探討HTA基因在肝癌中的作用機制。
　　方法：

4、⑴RACE PCR擴增HTA基因的全長并對其基因結構、可變剪接進行分析，對其編碼蛋白的特點進行預測。Northern blot檢測HTA不同轉錄本在肝癌細胞系及正常細胞系中的表達。⑵構建原核表達載體，在大腸桿菌Rosetta中表達GST-HTA融合蛋白，用GST瓊脂糖凝膠對融合蛋白進行純化并用凝血酶切除GST標簽，獲得具有生物活性的HTA蛋白。以HTA蛋白為抗原，用雜交瘤技術制備單克隆抗體并鑒定。以該抗體用于western blot、免

5、疫細胞化學檢測HTA在肝癌細胞中的表達，并初步研究HTA抗體抑制肝癌細胞系增殖的生物學功能。⑶構建HTA真核表達載體，在肝癌細胞系HepG2及HTA表達量較弱的肝癌宿主肝細胞系QSG-7701中穩(wěn)定過表達HTA基因，通過細胞增殖實驗、細胞周期檢測、克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗等體內(nèi)外實驗檢測HTA基因過表達對肝癌細胞系生物學表型的影響。⑷以干擾HTA基因前后的HepG2細胞系總RNA為材料，全基因組表達譜芯片雜交篩選HTA相關差異基因。生

6、物信息學GO分析和pathway分析HTA的相關差異基因及信號通路，實時熒光定量PCR和western blot檢測感興趣的HTA相關差異基因，明膠酶譜實驗、細胞粘附實驗、侵襲轉移實驗等進一步驗證HTA基因的生物學功能。⑸以HTA蛋白為誘餌，在標準化人cDNA文庫中，用酵母雙雜交方法篩選HTA的相互作用蛋白。結合生物信息學對篩選出來的HTA相互作用蛋白進行結構功能分析及其與HTA蛋白結合位點契合度分析，挑選感興趣的相互作用蛋白，進一步用

7、特異性雙雜交、免疫熒光實驗檢測兩者在細胞中的定位情況。
　　結果：①RACE PCR擴增得到HTA基因1414bp的全長序列。進一步分析HTA編碼蛋白閱讀框含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，而經(jīng)HTA基因全長驗證，第二號內(nèi)含子存在可變剪切。Northern blot結果顯示HTA基因在肝癌細胞系HepG2、QGY-7703中表達，而在正常細胞系HUVEC和正常肝細胞系L-02中均不表達。檢測到的HTA轉錄本和全長擴增所得序列長度一致。②

8、經(jīng)原核表達、純化得到了36kD大小的GST-HTA融合蛋白。凝血酶去除GST標簽后得到了10kD左右的HTA蛋白。以此為抗原制備了HTA單克隆抗體并純化，經(jīng)檢測該抗體(1mg/ml)效價為1∶10000，可用于western blot和免疫細胞化學檢測肝癌細胞系中HTA的表達。且HTA抗體對肝癌細胞系生長有抑制作用。③過表達HTA的肝癌細胞系生長增殖速度加快，克隆形成能力增強。細胞周期進程加快，在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力增強，在裸鼠皮下形成的

9、腫瘤中，過表達HTA細胞系腫瘤組織中HTA的表達量較高，且形成的腫瘤惡性程度較高。④干擾HTA前后的肝癌細胞系HepG2中，多個與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的基因表達發(fā)生了變化，其功能涉及生長、增殖、代謝等多個功能領域，經(jīng)qPCR和western blot驗證，HTA的差異表達引起了一些金屬蛋白酶類基因家族成員的表達變化，ADAM9、ADAM12、ADAM10、ADAM17、MMP9、MMP2等多個因子的表達與HTA的表達量同步變化。明膠酶譜實驗

10、檢測到MMP2和MMP9的活性在干擾HTA基因之后明顯下降。細胞粘附、侵襲、遷移實驗結果顯示HTA基因能夠增強肝癌細胞粘附、侵襲和轉移能力。⑤酵母雙雜交篩選出一批可能與HTA相互作用的蛋白。在蛋白結構位點分析基礎上進行特異性雙雜交及細胞免疫熒光實驗，結果顯示HTA蛋白能與LRP1相互作用，且二者共定位于細胞膜和胞質(zhì)。
　　結論：⑴克隆了新肝癌相關基因HTA的全長并通過Northern blot驗證。⑵得到了具有生物學活性的HTA蛋