基于FAIRE技術鑒定基因組中轉錄因子結合靶點的研究.pdf

1、目前，研究轉錄因子DNA結合位點(TFBS)的技術有:凝膠遷移實驗(EMSA)、染色質免疫沉淀(ChIP)技術、蛋白結合DNA微陣列芯片(PBM)、指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術、高通量測序-熒光配體互作圖譜分析(HiTS-FLIP)等等。ChIP技術是目前能夠檢測體內TFBS的唯一方法，該技術與高通量測序技術相結合產生的ChIP-Seq技術已經被廣泛地用于鑒定各種轉錄因子在細胞內的TFBS。但該技術實驗流程非常復雜且依賴高質量

2、抗體，因此，發(fā)展更為簡單的TFBS檢測新方法很有必要。
　　本文提出一種基于甲醛輔助分離調控元件（FAIRE）技術檢測基因組中TFBS的新方法。FAIRE技術是近年來才建立的新技術，該技術用酚氯仿抽提法將DNA分為兩部分，即為水相DNA和有機相DNA，F(xiàn)AIRE實驗只制備了水相DNA，將有機相直接舍棄，只有水相DNA顯然無法全面系統(tǒng)地揭示基因組信息。本研究除利用FAIRE技術分離水相DNA外，還用熱溫育解交聯(lián)法制各FAIRE技術中

3、舍棄的有機相DNA，利用水相和有機相DNA共同檢測體內DNA開放區(qū)及TFBS。本文提出的新方法檢測流程非常簡單，主要實驗步驟包括:培養(yǎng)細胞、甲醛交聯(lián)固定、制備染色質、超聲波打斷染色質、染色質解交聯(lián)制備INPUT DNA、FAIRE法制備水相DNA、熱溫育解交聯(lián)法制備有機相DNA，最后運用熒光定量PCR檢測制備的INPUT DNA、水相及有機相DNA，通過相對Ct值法計算檢測片段的富集倍數(shù)，鑒定染色質開放區(qū)及TFBS。
　　本論文針

4、對基因的轉錄起始區(qū)域和NF-κB靶基因的DNA結合位點，論證了該新方法的可行性。首先，針對NF-κB靶基因(IL6、TNFAIP3)和持家基因(GAPDH)的轉錄起始位點(TSS)上下游基因區(qū)域，設計了一系列引物，探索了TNF-α誘導與否HepG2細胞中基因啟動子區(qū)域染色質開放狀態(tài)的變化。實驗結果表明，誘導后，兩個靶基因相應引物的起伏變化，要比持家基因GAPDH顯著，而且對比同一基因引物誘導前后，水相DNA富集倍數(shù)升高，有機相DNA富集

5、倍數(shù)降低;說明本方法可成功檢測不同細胞狀態(tài)下染色質開放區(qū)。之后，本論文挑選了具有代表性的NF-κB靶基因(IL6、TNFRSF6、IL8、STAT5A、SLC12A7、IL7R、RELB、mir-219-1、mir-340)，對靶基因上含有NF-κBDNA結合位點的部位設計引物，通過PCR擴增TNF-α誘導與否HepG2細胞所制備的水相和有機相DNA，確證本方法可用于鑒定功能性TFBS。最后，利用ChIP-qPCR和RT-PCR對本方法