利用體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化外周血單個核細胞獲得內(nèi)皮祖細胞構(gòu)建組織工程化的毛細血管網(wǎng).pdf

1、目的：探討體外培養(yǎng)外周血單個核細胞，從而獲得內(nèi)皮祖細胞的方法及鑒定內(nèi)皮祖細胞的方法。分析不同培養(yǎng)條件對內(nèi)皮祖細胞增殖分化的影響；探討構(gòu)建三維組織工程化毛細血管網(wǎng)的方法，分析不同的種子細胞接種方法對內(nèi)皮祖細胞在細胞支架上生長情況的影響。 方法：細胞培養(yǎng)：抽取健康志愿者外周靜脈血15ml樣本24份，分為3組，其中實驗組14份，對照1、2組各5份。用梯度密度離心法獲取單個核細胞。實驗組將獲得的單個核細胞接種到表面包被有人纖維粘連蛋白的

2、培養(yǎng)瓶中，并采用VEGF和bFGF誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞的增殖、分化；對照1組不采用生長因子誘導(dǎo)；對照2組將單個核細胞接種到無纖維粘連蛋白包被的培養(yǎng)瓶中。原代細胞培養(yǎng)12天后傳代。觀察各組各代細胞形態(tài)學(xué)的變化。通過細胞克隆形成計數(shù)、單克隆細胞計數(shù)及MTT比色法等方法檢測各組細胞的增殖能力。對各組的原代細胞分別行CD34、CD133、Flk-1免疫組化染色，對各組的第3代細胞行CD31染色；對分離得到的單個核細胞及實驗組的第1、2、3代細胞行CD

3、34、CD133流式細胞學(xué)檢測，對各組的原代及第3代細胞行CD31流式細胞學(xué)檢測。對實驗組第3代的細胞行DiI-AcLDL攝取實驗及FITC-UEA-1結(jié)合實驗。細胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建及動物實驗：BALB/c裸鼠8只，以種子細胞接種方法的不同平均分為4組。實驗I組為支架吸收時間實驗組(空白對照組)，不接種種子細胞：實驗Ⅱ組為種子細胞全量接種組；實驗Ⅲ組為種子細胞半量接種組：實驗Ⅳ組為種子細胞全量多次接種組。使用粒子瀝濾法構(gòu)建HFN包被的

4、PLGA支架。利用實驗Ⅰ組的裸鼠動物模型檢測支架吸收時間。將體外培養(yǎng)獲得實驗組第3代細胞接種到支架后，繼續(xù)體外培養(yǎng)4周。掃描電鏡檢測內(nèi)皮祖細胞在支架上生長情況。將實驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組得到的細胞-支架復(fù)合物植入裸鼠背部皮下，待支架完全吸收后，切取裸鼠術(shù)區(qū)皮膚及包含細胞-支架復(fù)合物的皮下組織，行HE、CD31免疫組化染色和掃描電鏡檢測，并對切片行存在內(nèi)皮細胞的孔隙計數(shù)及內(nèi)膜完整并內(nèi)有紅細胞存在的孔隙計數(shù)。 結(jié)果：實驗組培養(yǎng)獲得的內(nèi)皮祖細

5、胞增殖分化能力明顯強于對照1、2組。實驗組第3代細胞中表達CD34+CD133+的的細胞較新分離的單個核細胞增加了79倍。實驗組第3代細胞具有正常內(nèi)皮系細胞的攝取DiI-acLDL，并結(jié)合FITC-UEA-1的生理功能。纖維粘連蛋白包被的PLGA支架在植入裸鼠皮下11周后被完全吸收。實驗組第3代內(nèi)皮祖細胞可以吸附并生長在生物可降解支架上。取材組織鑒定證明在細胞支架上可見存在內(nèi)皮細胞生長的孔隙及內(nèi)膜完整且內(nèi)有紅細胞存在的孔隙。這兩種有效孔

6、隙在實驗IV組的細胞．支架復(fù)合物上形成最多。 結(jié)論：體外培養(yǎng)外周血單個核細胞可以獲得具有增殖和分化為內(nèi)皮細胞能力的內(nèi)皮祖細胞，其數(shù)量和質(zhì)量均能滿足作為構(gòu)建組織工程化毛細血管網(wǎng)種子細胞的要求。內(nèi)皮祖細胞的增殖速度及增殖能力和細胞克隆形成能力與是否包被纖維粘連蛋白和生長因子的存在與否均相關(guān)。是否包被纖維粘連蛋白與內(nèi)皮祖細胞的分化無關(guān)，生長因子的存在使實驗組大量的內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞方向分化；纖維粘連蛋白包被的PLGA支架的微結(jié)構(gòu)、理