內(nèi)毒素對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響.pdf

1、近年來(lái)，在糖尿病足的治療方面有了很多的進(jìn)展，但仍有一部分患者因?yàn)椴〕梯^長(zhǎng)血管損傷嚴(yán)重，動(dòng)脈遠(yuǎn)端無(wú)流出道，使得臨床治療非常棘手，難以取得令人滿意的療效，最終導(dǎo)致截肢甚至危及患者的生命。因此，臨床上迫切需要尋找一種創(chuàng)傷小、患者容易接受且療效好的新的治療方法。干細(xì)胞移植技術(shù)的出現(xiàn)為糖尿病足的治療帶來(lái)了新的前景，近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。然而，臨床上干細(xì)胞移植治療糖尿病足受患者機(jī)體代謝狀態(tài)、血糖水平、氧化應(yīng)激及內(nèi)毒素等微環(huán)境因素影響

2、，臨床療效也相應(yīng)發(fā)生改變。因此，本研究通過(guò)觀察脂多糖（LPS）對(duì)外周血單個(gè)細(xì)胞(PBMCs)向血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)分化過(guò)程的影響，為臨床干細(xì)胞治療糖尿病足的最佳時(shí)機(jī)奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：觀察不同濃度LPS對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞體外向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化能力的影響。
　　方法：無(wú)菌條件下取健康成人外周血20ml,肝素抗凝，應(yīng)用密度梯度離心法分離成人外周血單核細(xì)胞，向DMEM-F12培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)20％的胎牛血清、血管

3、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），對(duì)PBMNCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，收集貼壁細(xì)胞培養(yǎng)后加入不同濃度 LPS（0.00μ g/mL、0.01μ g/mL、0.10μ g/mL、1.00μ g/mL、10.00μ g/mL）并干預(yù)72h，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志Flk-1，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)；20天后運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)CD31和vWF情況。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

4、　　結(jié)果：
　　①誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：倒置相差顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組1（LPS0.00μ g/mL）中細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)呈貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)VEGF和bFGF誘導(dǎo)后，原代細(xì)胞多呈圓形和梭形，接著形成細(xì)胞集落，隨后可見(jiàn)部分細(xì)胞融合，細(xì)胞呈鋪路石樣排列生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組2-5：（LPS0.01-10μg/mL）倒置相差顯微鏡下，PBMCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)與實(shí)驗(yàn)組1基本相同，均經(jīng)歷了小圓形→梭形→扁平細(xì)胞的演變過(guò)程。但實(shí)驗(yàn)組2（0.01μg/mL

5、 LPS）貼壁的細(xì)胞更多，最后形成的梭形細(xì)胞數(shù)量也最多；實(shí)驗(yàn)組3至實(shí)驗(yàn)組5，隨著LPS濃度的增加，貼壁細(xì)胞及梭形細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。
　?、诹魇郊?xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，體外經(jīng)VEGF和bFGF誘導(dǎo)分化后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組1 FLK-1陽(yáng)性細(xì)胞、CD31/vWF雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與實(shí)驗(yàn)組1相比較，0.01μg/mL LPS干預(yù)組 FLK-1陽(yáng)性細(xì)胞、CD31/vWF雙陽(yáng)性細(xì)胞升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而0.

6、10μg/mL LPS對(duì)FLK-1陽(yáng)性細(xì)胞、CD31/vWF雙陽(yáng)性細(xì)胞呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.00μg/mL和10.00μg/mL LPS干預(yù)組FLK-1陽(yáng)性細(xì)胞、CD31/vWF雙陽(yáng)性細(xì)胞明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：可通過(guò)密度梯度離心法和貼壁黏附培養(yǎng)法相結(jié)合從外周血中分離、純化獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞。體外培養(yǎng)的外周血單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)，成功分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示外周血