飛蝗幾丁質脫乙?；富虻漠愒幢磉_及其在后腸中的功能研究.pdf

1、飛蝗是我國重要農業(yè)害蟲，目前對其防治主要依靠化學農藥，但不合理的化學防治不僅導致環(huán)境的污染，而且導致飛蝗抗藥性的產(chǎn)生和對非靶標生物的危害。因此，探索新型、環(huán)境友好型飛蝗防治方法日趨重要。
　　昆蟲的發(fā)育會發(fā)生周期性去除舊表皮的幾丁質代謝過程。幾丁質是昆蟲表皮、消化道及體內組織所特有的組成成分。在幾丁質降解過程中幾丁質脫乙?；福–DAs）起重要作用，可以催化幾丁質中由β-1,4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０坊撊ヒ阴；?，形成

2、脫乙酰幾丁質（殼聚糖）。因此，基于昆蟲幾丁質降解途徑研發(fā)環(huán)境友好型殺蟲劑備受關注。
　　本研究以飛蝗LmCDAs基因為研究對象，采用真核表達系統(tǒng)，通過體外表達目的基因、純化目的蛋白，并對其酶活力進行檢測，從而探索該蛋白基因在體外的脫乙酰功能；其次，本研究還對該基因進行了原核表達和親和純化，并制備其特異性的多克隆抗體，為探索該基因在飛蝗后腸的功能研究提供了基礎材料；最后，基于課題組前期的研究基礎，我們使用制備成功的特異性多克隆抗體探

3、索LmCDA1和LmCDA2基因對飛蝗后腸發(fā)育的影響。該研究為探討基因在幾丁質代謝過程中的功能特性提供了重要的基礎數(shù)據(jù)，并為篩選殺蟲劑新靶標，研發(fā)環(huán)境友好型殺蟲劑以及以農業(yè)害蟲飛蝗的幾丁質作為底物的殼聚糖生產(chǎn)方法提供理論依據(jù)。本文主要從以下三個內容進行研究：
　　一、飛蝗LmCDA1和LmCDA2的真核表達、親和純化及酶活性研究
　　采用PCR法擴增飛蝗LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b基因，純化回收后瓊脂糖凝膠電

4、泳檢測回收產(chǎn)物。選擇pFastBac?-Dual作為中間載體，將中間載體和回收產(chǎn)物雙酶切進行重組質粒的構建。隨后進行重組桿狀病毒的構建。將構建好的重組桿狀病毒轉染Sf9細胞，獲得重組LmCDAs蛋白，通過western blot和12％SDS-PAGE膠上電泳等方法驗證、純化重組LmCDAs蛋白，并進行初步的酶活力測定。
　　結論：飛蝗幾丁質脫乙?；窵mCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b在體外均具有脫乙酰功能，并且統(tǒng)計分析

5、結果顯示三者在酶活力上表現(xiàn)顯著性差異。
　　二、飛蝗LmCDA1和LmCDA2的原核表達、純化及抗體制備與驗證
　　設計引物進行目的基因的克隆和純化，選取pET32a作為中間載體構建重組質粒pET32a-LmCDA1和pET32a-LmCDA2，將構建成功的重組質粒轉入大腸桿菌中進行目的蛋白的誘導表達，采用Western blot技術對表達產(chǎn)物進行檢測；將成功表達的蛋白使用Ni-NTA親和層析柱進行目的蛋白的純化，純化組分采

6、用12%SDS-PAGE方法檢測其純化結果，然后測定純化后的蛋白濃度，將濃度達到10mg的純化蛋白送至生物公司進行抗體制備?？贵w合成后，使用Western blot技術進行抗體的驗證。
　　結論：重組載體質粒pET32a-LmCDA1和pET32a-LmCDA2可在大腸桿菌中經(jīng)過100mM IPTG誘導劑，37℃誘導4h獲得目的蛋白的表達，并且可借助大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得大量目的蛋白以達到抗體制備所需的濃度和純度。
　　三

7、、LmCDA1和LmCDA2基因在飛蝗后腸中的組織定位和功能分析
　　通過免疫組化技術檢測LmCDAs基因在飛蝗后腸中的組織定位。通過RNAi干擾與透射電鏡技術相結合的技術手段，研究LmCDAs基因對飛蝗后腸發(fā)育的影響。結論：免疫組化檢測結果顯示在五齡第8天飛蝗后腸中， LmCDA1和LmCDA2均定位在細胞質中。對五齡第8天飛蝗后腸中的超微結構進行觀察，結果表明LmCDA1和LmCDA2基因均對飛蝗后腸幾丁質片層結構的排布起關鍵