Blue native-PAGE分離復合物方法的建立及其在膜蛋白質復合物鑒定中的應用.pdf

1、蛋白質是細胞生物功能最主要的承擔者。但大多數(shù)細胞的生物學功能都是由蛋白質復合物而非單個蛋白質來完成,蛋白質復合物是蛋白質在體內發(fā)揮功能作用的一種重要形式。質膜作為細胞內外物質交換和信息交流的場所,涉及眾多蛋白質的共同作用來完成這些重要的生理功能。因而質膜蛋白質更加容易形成復合物,成為了復合物蛋白質組學研究的熱點。對蛋白質復合物尤其是質膜蛋白質復合物的鑒定,有利于我們從整體上理解蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡。然而,鑒定蛋白質復合物最主要的限

2、制因素是蛋白質復合物的分離方法。藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Blue native-PAGE or BN-PAGE)技術是分離膜蛋白質復合物強有效的工具。這項技術依靠考馬斯亮藍G-250染料使蛋白質帶上負電荷,同時采用溫和的非離子型去垢劑增溶膜樣品,使膜蛋白質復合物在近似天然的狀態(tài)下根據(jù)分子量大小得到分離。在蛋白質復合物得到分離后,可以切下第一向的泳道進行第二向SDS-PAGE,就能將各個復合物的亞基進行分離。該方法可以用來研究膜樣品

3、中多種復合物的組成,然而在突觸質膜復合物方面的研究中卻應用的很少。本實驗中,我們建立并優(yōu)化了Blue native-PAGE分離突觸質膜蛋白質復合物方法,并成功用于分析D-半乳糖誘導的C57 BL/6小鼠大腦皮層中突觸蛋白質表達的變化。最近研究發(fā)現(xiàn),通過連續(xù)注射D-半乳糖到嚙鼠動物體內產生的糖基化終末產物(AGEs)會導致學習與記憶功能的減退,即AGEs與神經疾病有關。在神經疾病中出現(xiàn)的學習與記憶功能退化或大腦病變都可能與突觸中蛋白質的

4、表達量的變化有關。為了評估AGEs對突觸蛋白質表達的影響,我們結合使用BN/SDS-PAGE與質譜蛋白質組學方法,比較D-半乳糖誘導的C57 BL/6小鼠和正常的C57 BL/6小鼠大腦皮層突觸蛋白質的表達情況。首先通過不連續(xù)蔗糖密度梯度離心的方法制備突觸質膜,然后用Blue native-PAGE結合SDS-PAGE對純化的突觸質膜樣品進行電泳分離,再經膠內酶解,最后結合LC-MS/MS質譜對各復合物的組分進行鑒定以及對誘導組與對照組

5、進行差異蛋白質組學分析。我們找到了一些已知的蛋白質復合物如syntaxin1B和synaptotagmin-1,同時也發(fā)現(xiàn)了一種潛在的新的蛋白質復合物,即rab3A和synaptotagmin-1。一共鑒定到了43個差異表達蛋白質,這些差異表達蛋白質主要參與體內的神經傳遞、能量代謝以及信號轉導等過程。同時我們對部分感興趣的差異表達蛋白質在Western-Blotting水平進行了驗證,結果與質譜鑒定結果一致。另外,我們檢測了MDA和SO

6、D的活性,發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖誘導的C57 BL/6小鼠中,SOD的平均活力顯著下降,而MDA水平則上升了。這些結果表明,在大腦中AGEs的累積導致了活性氧(ROS)的生成,破壞了能量代謝以及減弱了突觸中神經傳遞。因此,闡明在AGEs累積過程中的蛋白質變化將有利于我們進一步了解在神經疾病中學習與記憶缺損機制。
　　 總之,本實驗為質膜蛋白質組學研究中的膜蛋白質復合物的分離純化、膜蛋白質的差異分析等提供了一些方法學上的參考；證明了Bl