IP6對(duì)裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤的影響.pdf

1、目的：卵巢癌是最常見的三大婦科惡性腫瘤之一，因?yàn)樵诮馄式Y(jié)構(gòu)上卵巢接近于盆腔最深部，早期的病變不易被察覺，而一旦出現(xiàn)了臨床癥狀，已多屬晚期。其中上皮性卵巢癌比例最高，達(dá)90％，近年來，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，盡管在全面腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合化療方面醫(yī)療技術(shù)較前有了很大的提高，使得卵巢生殖細(xì)胞腫瘤等類別生存率較前有了大幅提高，但上皮性癌的5年生存率卻未見明顯改善，仍停留在20%～30%，一直處于死亡率最高、預(yù)后最差的婦科惡性腫瘤的首位。目前，仍以鉑類為

2、基礎(chǔ)的聯(lián)合化療作為手術(shù)治療卵巢癌的主要輔助方法，但是化療藥物在心理及生理上給患者所帶來的一系列不良反應(yīng)，一定程度上影響了癌癥的預(yù)后。因此尋找一種既可以降低毒性而又能提高療效的治療方法至關(guān)重要。近年來，科學(xué)家在對(duì)膳食纖維的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)----肌醇六磷酸對(duì)于腫瘤有著很大的防治作用。美國(guó)馬里蘭大學(xué)的Abulkalam M. Shamsuddin博士與美國(guó)國(guó)家癌癥研究院的研究員們經(jīng)過多年努力，發(fā)現(xiàn)IP6具有防治多種疾病的功效。它能抑

3、制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，減小癌灶體積；抗氧化，抑制并殺死自由基；防止生成腎結(jié)石；降低血脂濃度；保護(hù)心肌細(xì)胞免于心臟病發(fā)造成猝死；防止動(dòng)脈發(fā)生硬化等。大量文獻(xiàn)報(bào)道，IP6可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，或促進(jìn)或抑制某些基因及蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗癌作用。但是IP6須與肌醇結(jié)合后，才可達(dá)到其最佳療效，因IP6與肌醇作用可以產(chǎn)生IP3，從而進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤作用。目前已有其對(duì)大腸癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等抑瘤作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究及報(bào)道，并取得了

4、顯著療效。但 IP6聯(lián)合肌醇能否在卵巢癌的治療中發(fā)揮作用，目前國(guó)內(nèi)外并未見相關(guān)報(bào)道，對(duì)此我們尚不清楚。本課題研究的主要目的就是通過觀察IP6聯(lián)合肌醇及其與順鉑聯(lián)用對(duì)人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的影響，進(jìn)一步分析IP6聯(lián)合肌醇對(duì)上皮性卵巢癌生長(zhǎng)的抑制作用及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白 Bax及基因miRNA-21表達(dá)的影響，探討IP6聯(lián)合肌醇誘導(dǎo)上皮性卵巢癌凋亡的作用機(jī)理。
　　方法：⑴細(xì)胞培養(yǎng)：運(yùn)用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞株S

5、KOV3，用來建立裸鼠皮下移植瘤模型。⑵裸鼠皮下移植瘤模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組：選取4-6周齡，重16-18g的BALB/c Nude雌性裸小鼠，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中備用。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，消化，制成單細(xì)胞懸液，濃度大約為2.5×107個(gè)/ml，于無菌環(huán)境中接種在裸鼠皮下，每只裸鼠接種0.2ml細(xì)胞懸液（約合細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)/只）（Fig.1）。接種5天后，選取移植瘤生長(zhǎng)良好，直徑在3-5mm的裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組（Fig.2）

6、，每組均設(shè)六只，分別為對(duì)照組，IP6+肌醇組，順鉑組及IP6+肌醇聯(lián)合順鉑組（聯(lián)合用藥組）。⑶實(shí)驗(yàn)用藥的制備：實(shí)驗(yàn)所需的所有藥物均用0.9%的氯化鈉溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。⑷給藥方法：IP6+肌醇組按照300mg/kg的濃度予以灌胃，每天一次，連續(xù)28天；順鉑組予以3mg/kg/d腹腔注射，連續(xù)7天；對(duì)照組每天分別予以同實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水灌胃及腹腔注射；聯(lián)合用藥組則為IP6+肌醇300mg/kg灌胃,同時(shí)予以3mg/kg/d順鉑腹腔注射。

7、⑸裸鼠重量及移植瘤重量及體積的測(cè)量：實(shí)驗(yàn)開始每天觀察裸鼠一般狀況，包括精神狀態(tài)、進(jìn)食水及排便情況等，分別于用藥前及用藥后每周稱量裸鼠的重量并測(cè)量皮下移植瘤的最長(zhǎng)徑線（a）及最短徑線（b），單位為mm，并按照公式 V（mm3）=πab2/6計(jì)算移植瘤的體積。于停藥后24小時(shí)終止觀察，用脫頸法處死裸鼠，剝?nèi)∑は铝鼋M織，稱重，并計(jì)算腫瘤抑制率 IR（%）=（1-治療組腫瘤平均體積/對(duì)照組腫瘤平均體積）×100%。⑹免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)裸鼠皮下

8、移植瘤組織中 Bax蛋白的表達(dá)情況：取經(jīng)4%多聚甲醛固定的移植瘤組織（小于0.5cm×0.5cm×0.1cm）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，研究移植瘤組織中促凋亡蛋白 Bax的表達(dá)。⑺RT-PCR技術(shù)檢測(cè)移植瘤組織中miRNA-21的表達(dá)：取保存于-80℃冰箱未經(jīng)任何試劑處理的移植瘤組織，用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)其中miRNA-21的表達(dá)。⑻統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量方差分析，多樣本均數(shù)間比

9、較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以?x±S表示，等級(jí)資料采用K-W-H秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①細(xì)胞培養(yǎng)過程瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞成功建立裸鼠皮下移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中各組裸鼠的一般狀況，主要為精神狀態(tài)，用藥開始各組均較用藥前精神變差，但隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，除順鉑組外均較用藥開始時(shí)有所好轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組由好變差依次為：對(duì)照組、IP6+肌醇組、聯(lián)合用藥組、順鉑

10、組。順鉑組及聯(lián)合用藥組在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)體重有所下降，但隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，最終各組的裸鼠體重較前均有所增長(zhǎng)，順鉑組較對(duì)照組增長(zhǎng)緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余兩組與對(duì)照組無明顯差異。移植瘤體積各組亦是逐漸增長(zhǎng)，各治療組體積均明顯小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且聯(lián)合用藥組體積明顯小于兩單獨(dú)用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)第29天測(cè)得移植瘤重量，各治療組均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且聯(lián)合用藥組瘤重明顯小于兩單獨(dú)用藥

11、組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②移植瘤組織中Bax蛋白的表達(dá)情況：IP6+肌醇組、順鉑組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中Bax蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且聯(lián)合用藥組明顯高于IP6+肌醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而聯(lián)合用藥組與順鉑組間無明顯差異。③移植瘤組織中miRNA-21的表達(dá)情況：IP6+肌醇組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中miRNA-21表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而順鉑組與對(duì)照組

12、相比無明顯差異。
　　結(jié)論：⑴IP6+肌醇組移植瘤的體積及重量小于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明 IP6+肌醇對(duì)上皮性卵巢癌具有抑制作用。并且聯(lián)合用藥組瘤組織的體積及重量均明顯小于順鉑組，說明二者具有協(xié)同的抗癌作用。⑵IP6+肌醇組及聯(lián)合用藥組對(duì)裸鼠精神狀態(tài)等一般情況以及對(duì)裸鼠體重的影響均小于順鉑組，表明IP6具有低毒副作用的特點(diǎn)，且聯(lián)合用藥能減輕化療副反應(yīng)。⑶IP6+肌醇組、順鉑組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中Bax蛋白表達(dá)均高于