淫羊藿苷誘導骨髓間充質干細胞修復股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、目的:
　　1、兔股骨頭壞死模型制備:通過液氮冷凍法制備兔股骨頭壞死模型，探討兔股骨頭壞死的病理學變化過程，為研究股骨頭壞死提供更多可參考的造模方法。
　　2、淫羊藿苷濃度篩選:通過檢測不同濃度淫羊藿苷體外誘導骨髓間充質干細胞在不同時間點促進細胞增殖和分化的效果，篩選出最佳濃度和最佳時間。
　　3、兔股骨頭壞死研究:在液氮冷凍法成功制備兔股骨頭壞死的模型的基礎上，聯(lián)合髓芯鉆孔減壓術，在保障細胞活性與數量的前提下，將經淫

2、羊藿苷體外誘導的骨髓間充質干細胞植入股骨頭壞死減壓區(qū)，以期達到阻止骨破壞和促使新骨形成，增強修復成骨能力，提高股骨頭壞死治療效果，為臨床探索股骨頭壞死治療方案提供理論支持。
　　方法:
　　1.淫羊藿苷誘導兔骨髓間充質干細胞的實驗研究:取生長1周健康新西蘭白兔體外提取骨髓間充質原代干細胞進行培養(yǎng)，選取具有較高繁殖力的二代骨髓間充質干細胞，經0～10μMol淫羊藿苷體外誘導24h、48h、72h，制作各濃度各時間點樣本，經MT

3、T檢測、ALP活性檢測、ALP染色、茜素紅染色等技術檢測，結合熒光定量PCR測定BMP2、COL-1、OPN基因上調情況、western blot技術測定BMP2、COL-1、OPN蛋白表達影響。所得數據經統(tǒng)計學統(tǒng)計分析，篩選出最佳濃度、最佳時間點淫羊藿苷體外誘導出最佳活性和增殖能力的干細胞，與能夠提供營養(yǎng)并保持細胞活性的載體基質膠混合備用，基質膠冷凍保存呈液體，在22～35℃能夠快速成膠。
　　2.淫羊藿苷體外誘導骨髓間充質干細

4、胞移植修復股骨頭壞死的實驗研究:選取60只健康成年兔納入本實驗，將其分為A組（空白對照12只），B組（模型組12只），C組（髓芯減壓治療組12只），D組（髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植治療組12只），E組（髓芯減壓聯(lián)合淫羊藿苷誘導形成骨髓間充質干細胞治療組12）。采用改良式液氮冷凍法制備股骨頭壞死兔的動物模型，術后2周隨機取3只實驗兔，麻醉下行X線、螺旋CT檢查后采用耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖取材，行Micro-CT檢查及病理組織形態(tài)

5、學檢測，多項檢測確保造模成功。減壓組、干細胞組、淫羊藿苷組分批行髓心鉆孔減壓術，干細胞組、淫羊藿苷組在股骨頭壞死減壓區(qū)注入骨髓間充質干細胞、經過淫羊藿苷誘導骨髓間充質干細胞，各實驗組分別于術后2周、4周、8周隨機取3只實驗兔在麻醉下行X線、螺旋CT檢查，行耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖取材，行Micro-CT Micro-CT三維重建及骨微觀結構參數計算、病理組織學HE染色、免疫熒光等技術檢測股骨頭壞死區(qū)的修復情況。各組所得數據進行統(tǒng)計學分

6、析，得出結論。
　　成果:
　　1、采用液氮冷凍法成功制備兔股骨頭壞死模型:通過影像學及病理組織形態(tài)學檢測證實了液氮冷凍術后2周即出現(xiàn)兔股骨頭壞死的典型表現(xiàn)，并獲得各實驗組股骨頭壞死病理演變過程的客觀數據。
　　2、成功提取、培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，篩選出了淫羊藿苷誘導骨髓間充質干細胞的最佳濃度和最佳時間點，選定了基質膠和誘導后干細胞混合物以保障植入壞死區(qū)細胞活性的方法。
　　3、成功獲得各組兔股骨頭壞死各時間點檢

7、測指標原始數據，經統(tǒng)計分析差異顯著，有統(tǒng)計學意義，為臨床股骨頭壞死的研究提供了理論支持。
　　結論:
　　1、液氮冷凍法制備兔股骨頭壞死模型，術后2周經影像學及病理組織形態(tài)學檢測股骨頭骨小梁變細稀疏，排列混亂并有部分斷裂，骨髓腔內造血細胞減少，細胞變性死亡，空骨陷窩明顯增多，此類骨細胞輪廓消失、核固縮，髓腔內充血、凝血，并有大量壞死組織碎片存在，股骨頭負重區(qū)骨陷窩內軟骨細胞萎縮、核固縮，為股骨頭壞死病理學的典型表現(xiàn)，證實了液

8、氮冷凍術后2周即可制備兔股骨頭壞死模型。
　　2、0～10μMol淫羊藿苷體外誘導二代骨髓間充質干細胞24h、48h、72h的檢測結果顯示:淫羊藿苷作用于骨髓間充質干細胞48h，隨著濃度的增加，骨髓間充質干細胞數目增加，在48h內淫羊藿苷對骨髓間充質干細胞有增殖作用，在1州時增殖活性最高。淫羊藿苷作用時間為72h時，BMSCs的增殖能力下降，分化能力增強。淫羊藿苷促進間充質干細胞增殖和風化的最佳濃度是1μMol，最佳時間點是48h

9、。
　　3、通過Micro-CT對股骨頭內部微觀結構觀察，模型組股骨小梁結構紊亂稀疏、間距增寬、數量減少，部分存在骨小梁骨折，股骨頭骨形態(tài)變小，骨礦鹽密度明顯減少，而經過治療的髓芯減壓組，骨髓間充質干細胞組，淫羊藿苷組股骨頭壞死病變都有所改善，且淫羊藿苷組效果最好。以上結果表明，淫羊藿苷聯(lián)合骨髓間充質干細胞治療股骨頭壞死效果明顯，淫羊藿苷通過誘導骨髓間充質干細胞增殖及成熟來發(fā)揮治療作用的。統(tǒng)計學統(tǒng)計Micro-CT掃描所得骨結構主