RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細胞增殖和分化中的重要作用研究.pdf

1、智力障礙(ID)在神經(jīng)和精神疾病中十分常見，比如在阿爾茨海默病(AD)、自閉癥(ASD)中十分常見。智力障礙的病人的智商(IQ)往往較正常人低，小孩子伴有智力障礙者在學習語言、社會交往、自理能力方面較正常孩子緩慢。而自閉癥是一種以社會交往和溝通能力受損，重復的、刻板的行為學并常常伴有智力和認知功能障礙為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。
　　無義介導的mRNA降解（NMD）是控制RNA平衡和保證大量不必要的轉(zhuǎn)錄因子快速降解的一個RNA監(jiān)控

2、機制。這個機制依賴于外顯子連接復合物(EJC)的多個核心因子：真核細胞翻譯起始因子4AIII(eIF4AIII)、腫瘤易感候選基因3(BTZ)、人類同源果蠅 Mago nashi蛋白(MAGOH)和核糖核酸結(jié)合基序蛋白8a(RBM8a)及其附近的一些因子來區(qū)分在正常轉(zhuǎn)錄的終止密碼子之前的非成熟終止密碼子(PTCs)。最近，研究表明無義介導的mRNA降解因子與神經(jīng)發(fā)育性障礙疾病比如自閉癥、精神分裂癥(SCZ)、智力障礙性疾病有聯(lián)系。有遺傳

3、學研究揭示NMD在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)再生、細胞增殖和分化等功能有重要的作用，然而，這些因子是如何控制大腦發(fā)育的機制尚不清楚。核糖核酸結(jié)合基序蛋白8a(RBM8a)是一個在mRNA剪接過程中與RNA結(jié)合的核蛋白，RBM8a調(diào)節(jié)的特異性調(diào)控細胞功能尤其在調(diào)控神經(jīng)祖細胞增殖、分化和大腦發(fā)育的功能尚未被完全明確。因此，本研究擬在檢測RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細胞增殖和分化的功能，以明確RBM8a基因在調(diào)控大腦發(fā)育的作用，為揭示RBM8a在神經(jīng)發(fā)育障

4、礙性疾病的病因?qū)W提供理論基礎。
　　實驗內(nèi)容包括以下兩部分：
　　第一部分RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細胞增殖和分化中的作用
　　目的:檢測RBM8a在胚鼠不同階段和成年鼠之間的表達差異，在體外細胞系和胚鼠大腦中神經(jīng)祖細胞中過表達或沉默RBM8a，觀察細胞增殖和分化的改變，以明確RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細胞增殖和分化中的作用。
　　方法:將不同階段胚鼠和成年小鼠的大腦皮層組織分離、裂解并收集蛋白，使用wester

5、n blot進行檢測RBM8a的表達。分離14天胚鼠大腦中的神經(jīng)祖細胞，并在體外誘導其分化，觀察RBM8a的變化。收集16天胚鼠大腦并進行固定、冰凍切片，檢測胚鼠大腦皮層RBM8a表達。構(gòu)建沉默RBM8a的shRNA和過表達的RBM8a質(zhì)粒，并在CAD細胞系中證實其沉默和過表達的效果。在體外，分別用RBM8a的shRNA和過表達的RBM8a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAD細胞，并使用BrdU標記。在體內(nèi)，利用子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)移技術(shù)，將shRNA和過表達RB

6、M8a轉(zhuǎn)移到14天的胚鼠大腦皮層的神經(jīng)祖細胞內(nèi)，并用BrdU標記，以觀察RBM8a調(diào)控神經(jīng)祖細胞的增殖、分化和調(diào)節(jié)細胞周期進程。
　　結(jié)果:
　　1. RBM8a在胚胎早期神經(jīng)祖細胞增殖的時候，RBM8a的表達水平很高，而當胚鼠逐漸發(fā)育，神經(jīng)祖細胞分化的時候，RBM8a的表達水平亦隨之降低。
　　2.在體外，當神經(jīng)祖細胞分化的時候，RBM8a的水平明顯降低。在16天胚鼠大腦皮質(zhì)的室管膜層和室管膜下層，RBM8a與巢蛋白

7、陽性的神經(jīng)祖細胞中大量表達，而在雙腎上腺皮質(zhì)激素陽性的遷移神經(jīng)細胞和不成熟神經(jīng)元聚集的中間層和皮質(zhì)外層RBM8a表達明顯減少。RBM8a在CAD細胞被沉默后細胞分裂指數(shù)明顯降低，細胞增殖減少，而過表達RBM8a后，CAD細胞分裂指數(shù)明顯升高，促進細胞增殖。
　　3.在動物模型體內(nèi)，沉默胚鼠大腦皮質(zhì)中的RBM8a可見以神經(jīng)祖細胞為主室管膜層和室管膜下層的細胞減少，而增加了進入分化的神經(jīng)元所在的中間層和皮質(zhì)外層；相反，過表達胚鼠大腦皮

8、質(zhì)中的RBM8a后，轉(zhuǎn)移至中外層的細胞減少而在室管膜層和室管膜下層的細胞增多，表明RBM8a正性調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細胞的增殖。
　　4.在動物模型體內(nèi)，沉默胚鼠大腦皮質(zhì)RBM8a時，細胞周期退出指數(shù)增加32％，導致神經(jīng)祖細胞的減少，而分化成新生神經(jīng)元增多；相反，過表達RBM8a后，細胞周期退出指數(shù)減少30%，導致神經(jīng)祖細胞的增殖并抑制神經(jīng)祖細胞分化成新生的神經(jīng)元。
　　結(jié)論:RBM8a基因在調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)育扮演著重要作用；RBM8a

9、促進胚胎神經(jīng)祖細胞增殖和抑制神經(jīng)元的分化；RBM8a在維持神經(jīng)祖細胞增殖與分化的平衡中起重要作用。
　　第二部分基于RNA-seq技術(shù)對RBM8a調(diào)控的基因和信號通路分析
　　目的:通過以RNA-seq技術(shù)為基礎的轉(zhuǎn)錄組學分析，識別大腦中RBM8a可能調(diào)控的神經(jīng)精神疾病相關(guān)的下游基因和信號傳導通路。
　　方法:構(gòu)建過表達RBM8a質(zhì)粒pTRIPZ-mCherry-RBM8a和對照質(zhì)粒pTRIPZ-mCherry，將它們

10、包裝慢病毒載體，構(gòu)建過表達RBM8a的SH-SY5Y穩(wěn)定細胞系，利用強力霉素誘導過表達RBM8a在細胞系中表達，利用TRIzol試劑提取總RNA，使用RiboZero試劑盒選擇性的去除rRNA。使用Illumina Hi-Seq2500平臺，進行高通量RNA測序，使用軟件工具分析過表達RBM8a與對照組之間有顯著差異性表達的轉(zhuǎn)錄因子。將有差異性表達的基因列表與現(xiàn)有的不同的神經(jīng)精神疾病數(shù)據(jù)庫中高?；蛳嗷φ?，識別出他們之間重疊的基因，并

11、進一步使用western blot在CAD細胞中驗證RNA-seq有差異表達的基因的蛋白表達是否一致。利用DAVID生物信息分析軟件，分析RBM8a下游有差異表達的基因可能參與調(diào)控的信號傳導通路。最后分析本研究中有差異表達的基因是否導致有差別的選擇性剪接，是否有通過NMD調(diào)控的靶點基因。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建過表達RBM8a質(zhì)粒，提取總RNA并取出rRNA后，利用高通量RNA測序和分析，最終過表達RBM8a組和對照組

12、的mRNA測序，超過95%的閱讀都被映射到參考基因組。
　　2.通過分析發(fā)現(xiàn)，過表達RBM8a后有7.08%的轉(zhuǎn)錄因子相對于對照組有差異。過表達RBM8a的眾多下游基因與智力障礙、阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥數(shù)據(jù)庫中的高危基因重合。自閉癥高危蛋白（NLGN1），退行性神經(jīng)疾病蛋白（ATXN1），神經(jīng)再生蛋白（REST），胚胎發(fā)育（TLE4）和神經(jīng)遷移蛋白（KIF1A）在RBM8a過表達CAD細胞中表達與RNA測序結(jié)果一致，而沉

13、默RBM8a的CAD細胞中表達與RNA測序結(jié)果相反。
　　3. DAVID生物信息工具分析結(jié)果提示RBM8a調(diào)控了包括絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶等信號傳導通路、生長因子信號傳導通路、Rho信號傳導通路、包含整合素和膠原蛋白在內(nèi)的細胞外基質(zhì)受體傳導通路、鈣離子信號信號傳導通路中的許多重要基因。
　　4.本研究中371個選擇性剪接事件中有101蛋白編碼基因有顯著性差異，這些選擇性剪接的基因中許多與自閉癥(ASD)的高?；?/p>