維甲酸對大鼠急性脊髓損傷后血脊髓屏障保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　在急性脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)早期時，血-脊髓屏障(blood-spinalcord barrier，BSCB)會發(fā)生不可逆破壞，導(dǎo)致血管源性脊髓水腫，后者在繼發(fā)性脊髓損傷中起至關(guān)重要作用，大量研究證明，炎癥、自由基及其它眾多因子均與BSCB的破壞有關(guān)。維甲酸(Retinoic acid，RA)是一種維生素A的衍生物，對于胚胎發(fā)育起著重要作用尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，能選擇性促進(jìn)神經(jīng)

2、嵴前體細(xì)胞的增殖與分化，也可以通過抗炎、抗氧化、促進(jìn)神經(jīng)再生等多種機(jī)制起到中樞神經(jīng)保護(hù)作用。最近研究表明，維甲酸在大鼠胚胎時期參與血腦屏障(blood-braincord barrier，BBB)及血脊髓屏障的形成與分化，并促進(jìn)大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白的表達(dá)。既往研究維甲酸對BSCB的研究多側(cè)重于其在生理情況下對血腦屏障和血脊髓屏障的作用。但是在病理情況下，如腦損傷或脊髓損傷時對血腦屏障和血脊髓屏障的通透性影響和作用機(jī)制還不

3、清楚。本研究通過脊髓動脈夾夾傷法，制備SD大鼠脊髓損傷模型，觀察血脊髓屏障通透性的變化，緊密連接蛋白表達(dá)的改變，以及維甲酸治療后的效果。進(jìn)一步探索維甲酸對脊髓損傷時血脊髓屏障保護(hù)作用機(jī)制。
　　第一部分維甲酸對脊髓損傷后血脊髓屏障的保護(hù)作用及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)
　　目的:觀察大鼠在急性脊髓損傷早期時血脊髓屏障的通透性、緊密連接蛋白表達(dá)的變化及神經(jīng)功能恢復(fù)情況，觀察大鼠急性脊髓損傷早期維甲酸對血脊髓屏障的保護(hù)效應(yīng)。
　　方

4、法:采用動脈血管夾(30g，2min)壓迫脊髓的方法來制作大鼠急性脊髓損傷的動物模型，用54只SD雌性大鼠造模后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷組(SCI)、脊髓損傷維甲酸治療組(SCI+RA)。采用BBB法對其后肢運(yùn)動功能進(jìn)行評分，在各組動物手術(shù)后24小時，對大鼠進(jìn)行麻醉處死，心臟灌注，然后獲得的損傷脊髓節(jié)段組織標(biāo)本進(jìn)行二甲基甲酰胺(DMF)法檢測伊文氏藍(lán)濃度，免疫熒光雙染法檢測緊密連接蛋白Occludin和CD31的表達(dá)，通

5、過western blot法來檢測緊密連接蛋白Occludin，Claudin5，β-catenin，P120-catenin表達(dá)變化。
　　結(jié)果:維甲酸治療組(15 mg/kg)能夠顯著抑制脊髓損傷后伊文氏藍(lán)向脊髓實(shí)質(zhì)的滲透量(P＜0.05);在血管結(jié)構(gòu)中，維甲酸治療能夠維持脊髓微血管的整體結(jié)構(gòu)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，維護(hù)血脊髓屏障的緊密連接完整。此外，維甲酸能夠顯著抑制脊髓損傷所引起的緊密連接相關(guān)蛋白Occludin，Claudin5

6、，β-catenin，P120-catenin表達(dá)的下調(diào)(P＜0.05)。BBB評分顯示維甲酸治療組SCI+RA組明顯高于SCI組(p＜0.01)。
　　結(jié)論:維甲酸在脊髓損傷時能夠通過抑制血脊髓屏障的滲透性，上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，促進(jìn)大鼠脊髓損傷后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)。
　　第二部分維甲酸對血脊髓屏障的保護(hù)作用是通過上調(diào)自噬后抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑介導(dǎo)的
　　目的:初步探討維甲酸對血脊髓屏障保護(hù)作用機(jī)制及自噬、內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)應(yīng)激與血脊髓屏障的破壞的相關(guān)性。
　　方法及結(jié)果：
　　(1)在第一部分實(shí)驗(yàn)中的三組老鼠:假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷對照組(SCI)、脊髓損傷維甲酸治療組(SCI+RA)，通過免疫熒光法和western blot法分別檢測自噬相關(guān)蛋白(P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、PDI、caspase-12、CHOP)的表達(dá)情況。結(jié)果表明在模型組中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)輕微上升，而相對于模型組

8、維甲酸治療組LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增高，相反P62蛋白表達(dá)在模型組輕微下降而在維甲酸治療組顯著下降;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、PDI、caspase-12、CHOP的表達(dá)在模型組都顯著增加，而在維甲酸治療組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、 PDI的表達(dá)相對于模型組相比無顯著性差異，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白caspase-12、CHOP的表達(dá)在維甲酸治療組顯著下降。
　　(2)在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了探索維甲酸是否通過上調(diào)自噬來抑制內(nèi)

9、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的。因此，我們引入了自噬抑制劑3-MA、氯喹(CQ)，結(jié)果顯示當(dāng)阻斷自噬通路時維甲酸的血脊髓屏障保護(hù)作用被抑制了，維甲酸對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白caspase-12、CHOP的抑制作用也被廢除了，而對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、 PDI的表達(dá)無有影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們用10μM毒胡蘿卜素(TG)誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，用維甲酸（1μM或5μM）進(jìn)行藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)維甲酸能夠抑制胡籮卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋