新甾醇類藥物NSC67657誘導白血病細胞HL-60單核系分化及其機制研究.pdf

1、目的：構建新甾醇類藥物NSC6767誘導白血病細胞HL-60向單核系分化的細胞模型，檢測藥物對細胞的生物學行為的影響、探討其可能的分子機制。
　　方法：以10μmol/L NSC67657藥物處理HL-60細胞5 d構建細胞分化模型，以DMSO溶劑處理HL-60細胞5 d為對照組；采用瑞氏染色、堿性α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE）染色分析細胞的分化方向；采用流式細胞術分析細胞的分化程度、細胞周期分布、細胞凋亡的情況；采用乳酸脫氫酶（

2、LD）檢測試劑盒檢測藥物對細胞的毒性作用；采用RT-PCR和Western blot分析ICAT、β-catenin、T細胞因子4（TCF-4）的mRNA和蛋白在細胞分化前后的表達情況；采用Western blot和免疫熒光染色方法檢測細胞分化前后β-catenin，TCF-4在細胞內定位情況。采用RT-PCR和Western blot分析Wnt信號通路下游靶基因c-myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、TCF-1 mRNA和

3、蛋白在細胞分化前后的表達情況；
　　結果：瑞氏染色后觀察發(fā)現(xiàn)：細胞在10μmol/L NSC67657作用5 d后細胞質明顯增多，核仁消失，細胞核呈圓形或不規(guī)則形；α-NBE染色結果顯示：對照組胞質無色，為陰性，實驗組胞質中出現(xiàn)鮮紅色的顆粒沉淀，為陽性，并能被氟化鈉(NaF)抑制，抑制率>50％。流式細胞術（FCM）結果顯示：10μmol/L NSC67657作用5 d后的實驗組CD14+細胞數(shù)為（94.37±2.84）%，高于對

4、照組[（1.31±0.09）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；實驗組G1/G0期細胞所占比例為（76.46±2.83）%，高于對照組[（59.4±5.42）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；實驗組S期細胞所占比例為（18.76±0.98）%，低于對照組[（34.38±2.61）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；藥物處理前后的HL-60細胞早期和晚期凋亡均無明顯改變（均P>0.05）；LD檢測結果顯示，LD活性也并無明顯

5、改變（P>0.05）。RT-PCR、western blot結果顯示：藥物作用后HL-60細胞中ICAT表達水平上調(均P<0.01)；β-catenin表達水平下調(均P<0.01)；細胞核中β-catenin蛋白的水平下調(P<0.01)；TCF-4表達水平無明顯改變（均P>0.05）；細胞核中的 TCF-4無明顯改變（P>0.05）；Wnt信號通路下游靶基因c-myc、cyclin D1、TCF-1的mRNA和蛋白表達水平均下調(

6、均P<0.05)。免疫熒光染色結果顯示：細胞核中的β-catenin蛋白減少，TCF-4無明顯改變。
　　結論：NSC67657可誘導白血病細胞 HL-60向單核系分化，抑制細胞增殖，但不誘導細胞凋亡，且對細胞無毒副作用；在HL-60向單核系誘導分化的過程中，ICAT表達上調，Wnt信號通路關鍵調節(jié)因子β-catenin及下游靶基因的表達下調。提示：ICAT可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路參與了NSC67657誘導白