甘露醇誘導人腎小管上皮細胞損傷及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　臨床病理資料和大量的動物實驗已經證明，長時間大劑量給予甘露醇會導致腎近端小管上皮細胞出現(xiàn)廣泛的空泡樣變性，上皮細胞腫脹，腎皮質淤血等各種腎小管病理形態(tài)改變并誘發(fā)急性腎損傷。前期體外實驗結果顯示，較高劑量的甘露醇會損傷腎小管上皮細胞。在本研究中，我們將通過建立甘露醇體外損傷腎小管上皮細胞模型，進一步研究甘露醇的細胞毒性及其潛在的損傷機制。
　　方法：
　　通過MTT比色法檢測甘露醇不同濃度（0、50、100、

2、150、200、250、300、400 mmol/L）分別作用不同時間（4、10、24、48、72 h）對人腎小管上皮細胞（HK-2）活性的影響，同時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。用含有0、100、250 mmol/L的甘露醇作用于HK-2細胞24、48、72 h之后，收集細胞，超聲破碎，分光光度法檢測細胞勻漿液中脂質過氧化指標丙二醛(MDA）的含量和細胞內谷胱甘肽（GSH）的含量。用含有0、100、250 mmol/L的甘露醇孵育

3、HK-2細胞48 h后，收集各組細胞，AnnexinV-FITC雙染法進行標記，用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。此外，用不同濃度的甘露醇處理 HK-2細胞不同時間后，將細胞固定，細胞核用 DAPI標記，細胞中的 F-actin蛋白用 FITC-phalloidin（鬼筆環(huán)肽）進行免疫熒光標記，在顯微鏡下觀察細胞骨架的改變。
　　結果：
　?、臡TT結果顯示，細胞的活性隨著甘露醇濃度（100~400 mmol/L）的增加和

4、作用時間(24~72 h)的延長而逐漸下降，在250 mmol/L甘露醇孵育48 h時，細胞活力約為對照組細胞的一半。⑵倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，對照組中，細胞呈鋪路石狀，伸展平鋪在板底，且貼壁生長情況良好。而在250 mmol/L甘露醇作用48 h組，細胞明顯出現(xiàn)腫脹變大，胞膜破裂，大部分貼壁細胞出現(xiàn)脫落，而且隨著甘露醇濃度的增加和作用時間的延長，可以觀察到貼壁細胞密度明顯減少。⑶細胞中MDA和GSH的含量變化：在250 mmol

5、/L甘露醇的作用下，HK-2細胞中MDA含量隨著作用時間的延長而增多。250 mmol/L甘露醇分別孵育細胞24、48、72 h后，MDA含量增高，與各個時間點的對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。甘露醇降低細胞內 GSH含量，而且呈時間劑量依賴性。在250 mmol/L甘露醇作用48 h組，GSH含量降低到18.3±4.3?mol/g，顯著低于對照組（52.2±1.6?mol/g）（P<0.05）。⑷流式細胞儀結果顯示，250