DNA甲基化調(diào)控紅豆杉細胞中紫杉醇合成機理初探.pdf

1、紅豆杉細胞系在繼代培養(yǎng)過程中存在紫杉醇含量不穩(wěn)定問題,表現(xiàn)為隨著繼代次數(shù)的增加,紫杉醇含量逐漸下降。前期研究發(fā)現(xiàn),這種不穩(wěn)定現(xiàn)象與紅豆杉細胞系在繼代過程中甲基化水平升高有密切關系,但作用機制尚不明確。本研究利用蛋白質(zhì)組技術對去甲基化試劑(5-Aza-CdR)處理前后的紅豆杉細胞進行差異蛋白解析,以期揭示DNA甲基化調(diào)控紫杉醇合成的機理,獲得的主要結(jié)果如下:
　　1)建立了HPLC測定紅豆杉基因組DNA甲基化水平的方法。最優(yōu)的方案為

2、:37℃DNAdegradase(ZymoResearchCorp,Cat.E2017)水解3h;流動相采用:溶劑A為50mmol/L磷酸二氫鉀水溶液:三乙胺=100:0.2(pH=5.8),溶劑B為甲醇,梯度設置為10％甲醇,檢測波長285nm。此種方法采用酶水解方法實現(xiàn)了僅需3ugDNA就能達到HPLC檢測的需求,而且防止了5-甲基胞嘧啶的降解破壞,且此方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性。
　　2)建立了適合紅豆杉細胞的蛋白質(zhì)雙向電

3、泳體系。研究表明,采用TCA-丙酮法提取蛋白,pH4-7范圍膠條以及改進的IEF聚焦程序,所有樣品均獲得了清晰的2-DE圖譜,可讀點都在2000個以上。所建立的實驗體系重復性好,為紅豆杉細胞蛋白質(zhì)組學的研究打下了良好的基礎。
　　3)通過對去甲基化試劑處理前后的紅豆杉細胞總蛋白的2-DE差異蛋白質(zhì)組學研究,共找到表達差異在1.5倍以上的差異蛋白點121個,質(zhì)譜鑒定出62個點,其中有33個是新蛋白,功能未知;29個已知功能蛋白,可分

4、為:細胞防御蛋白(Defense/Desease)、碳水化合物代謝蛋白(CarbohydrateMetabolism)、能量代謝蛋白(EnergyMetabolism)、脂代謝蛋白(LipidMetabolism)、次生代謝蛋白(SecondaryMetabolites)、細胞生長和凋亡蛋白(CellGrowthandDeath)、轉(zhuǎn)運和分解蛋白(TransportandCatabolism)及其他(Other)未知功能的蛋白。

5、　　4)克隆了部分差異表達蛋白及紫杉醇合成相關酶,并采用熒光定量RT-PCR技術對表達量進行分析。結(jié)果表明:咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(F14)基因與蛋白的表達趨勢完全相同,分析了微管蛋白(A3)、ATP合成酶(C3)、細胞生長相關蛋白(C4)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(D14)、熱休克蛋白(E3)、肌動蛋白(M1)6個基因與蛋白的表達量存在差異,推測由于生物體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而導致基因與蛋白水平表達趨勢的差異;發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR對甲

6、基轉(zhuǎn)移酶基因MET5的影響較大,對MET1、MET4的影響較小,說明5-Aza-CdR對甲基轉(zhuǎn)移酶的影響具有選擇性;發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR處理后紫杉醇合成過程中的關鍵酶基因(TS、DBAT、BAPT)的表達量均提高。
　　5)通過對去甲基化試劑處理不同時期紅豆杉細胞的蛋白水平及基因水平的綜合分析,初步預測了甲基化調(diào)控紫杉醇合成的機理。5-Aza-CdR處理紅豆杉細胞后能夠降低細胞基因組甲基化水平,同時激活了多種途徑來參與紫杉醇的合

7、成。①5-Aza-CdR能夠激活能量代謝途徑、磷酸戊糖途徑、脂肪酸代謝途徑及其他生物學途徑,這些途徑能夠為紫杉醇的合成提供NADPH、能量、乙酰輔酶A、3-磷酸甘油醛等物質(zhì)與能量基礎。②同時5-Aza-CdR刺激了紫杉醇合成途徑中關鍵酶基因的表達,故紫杉醇含量在甲基化水平降低的同時不斷提高。③隨著紫杉醇含量的提高及甲基化酶與DNA共價體的進一步合成,對細胞造成傷害,通過信號轉(zhuǎn)導途徑,最終引起植物的脅迫反應。隨著5-AZa-CdR濃度及活