DNA甲基化調(diào)控紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇合成機(jī)理初探.pdf

1、紅豆杉細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)過程中存在紫杉醇含量不穩(wěn)定問題,表現(xiàn)為隨著繼代次數(shù)的增加,紫杉醇含量逐漸下降。前期研究發(fā)現(xiàn),這種不穩(wěn)定現(xiàn)象與紅豆杉細(xì)胞系在繼代過程中甲基化水平升高有密切關(guān)系,但作用機(jī)制尚不明確。本研究利用蛋白質(zhì)組技術(shù)對去甲基化試劑(5-Aza-CdR)處理前后的紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白解析,以期揭示DNA甲基化調(diào)控紫杉醇合成的機(jī)理,獲得的主要結(jié)果如下:
　　1)建立了HPLC測定紅豆杉基因組DNA甲基化水平的方法。最優(yōu)的方案為

2、:37℃DNAdegradase(ZymoResearchCorp,Cat.E2017)水解3h;流動(dòng)相采用:溶劑A為50mmol/L磷酸二氫鉀水溶液:三乙胺=100:0.2(pH=5.8),溶劑B為甲醇,梯度設(shè)置為10％甲醇,檢測波長285nm。此種方法采用酶水解方法實(shí)現(xiàn)了僅需3ugDNA就能達(dá)到HPLC檢測的需求,而且防止了5-甲基胞嘧啶的降解破壞,且此方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
　　2)建立了適合紅豆杉細(xì)胞的蛋白質(zhì)雙向電

3、泳體系。研究表明,采用TCA-丙酮法提取蛋白,pH4-7范圍膠條以及改進(jìn)的IEF聚焦程序,所有樣品均獲得了清晰的2-DE圖譜,可讀點(diǎn)都在2000個(gè)以上。所建立的實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)性好,為紅豆杉細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　3)通過對去甲基化試劑處理前后的紅豆杉細(xì)胞總蛋白的2-DE差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,共找到表達(dá)差異在1.5倍以上的差異蛋白點(diǎn)121個(gè),質(zhì)譜鑒定出62個(gè)點(diǎn),其中有33個(gè)是新蛋白,功能未知;29個(gè)已知功能蛋白,可分

4、為:細(xì)胞防御蛋白(Defense/Desease)、碳水化合物代謝蛋白(CarbohydrateMetabolism)、能量代謝蛋白(EnergyMetabolism)、脂代謝蛋白(LipidMetabolism)、次生代謝蛋白(SecondaryMetabolites)、細(xì)胞生長和凋亡蛋白(CellGrowthandDeath)、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解蛋白(TransportandCatabolism)及其他(Other)未知功能的蛋白。

5、　　4)克隆了部分差異表達(dá)蛋白及紫杉醇合成相關(guān)酶,并采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明:咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(F14)基因與蛋白的表達(dá)趨勢完全相同,分析了微管蛋白(A3)、ATP合成酶(C3)、細(xì)胞生長相關(guān)蛋白(C4)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(D14)、熱休克蛋白(E3)、肌動(dòng)蛋白(M1)6個(gè)基因與蛋白的表達(dá)量存在差異,推測由于生物體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而導(dǎo)致基因與蛋白水平表達(dá)趨勢的差異;發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR對甲

6、基轉(zhuǎn)移酶基因MET5的影響較大,對MET1、MET4的影響較小,說明5-Aza-CdR對甲基轉(zhuǎn)移酶的影響具有選擇性;發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR處理后紫杉醇合成過程中的關(guān)鍵酶基因(TS、DBAT、BAPT)的表達(dá)量均提高。
　　5)通過對去甲基化試劑處理不同時(shí)期紅豆杉細(xì)胞的蛋白水平及基因水平的綜合分析,初步預(yù)測了甲基化調(diào)控紫杉醇合成的機(jī)理。5-Aza-CdR處理紅豆杉細(xì)胞后能夠降低細(xì)胞基因組甲基化水平,同時(shí)激活了多種途徑來參與紫杉醇的合

7、成。①5-Aza-CdR能夠激活能量代謝途徑、磷酸戊糖途徑、脂肪酸代謝途徑及其他生物學(xué)途徑,這些途徑能夠?yàn)樽仙即嫉暮铣商峁㎞ADPH、能量、乙酰輔酶A、3-磷酸甘油醛等物質(zhì)與能量基礎(chǔ)。②同時(shí)5-Aza-CdR刺激了紫杉醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá),故紫杉醇含量在甲基化水平降低的同時(shí)不斷提高。③隨著紫杉醇含量的提高及甲基化酶與DNA共價(jià)體的進(jìn)一步合成,對細(xì)胞造成傷害,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,最終引起植物的脅迫反應(yīng)。隨著5-AZa-CdR濃度及活