生物轉化法應用重組谷氨酸脫羧酶合成γ-氨基丁酸.pdf

1、學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位是本人在導師指導下進行的研究工作和取得的研究成果。本論文中除引文外，所有實驗、數(shù)據(jù)和有關材料均是真實的。本論文中除引文和致謝的內容外，不包含其他人或其它機構已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究所做的貢獻均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學位論文作者簽名：易籮遺日期：圳小叩學位論文使用授權聲明研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬南京師范大學。學校有權保存本學位論文的電子和紙質文

2、檔，可以借閱或上網(wǎng)公布本學位論文的部分或全部內容，可以采用影印、復印等手段保存、匯編本學位論文。學?？梢韵驀矣嘘P機關或機構送交論文的電子和紙質文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學位論文屬于保密論文，保密期限為年。學位論文作者簽名：日期：指導教師彌參孫日期：洲夕≯7，’摘要摘要lIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIY1922032^r氨基丁酸“aminobutyricacid，GABA)是一

3、種以自由態(tài)形式存在的非蛋白質組成氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質。GABA具有多種生理功能，如降血壓、預防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、促進激素分泌和保肝利腎等，其制備和應用廣受人們的關注與重視。谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD；EC41115)催化L一谷氨酸脫羧生成GABA，是生物催化谷氨酸脫羧生成GABA的限速酶。盡管大腸桿菌GAD和GABA合成已經(jīng)進行了廣泛的研究，但如何獲取高活

4、性的重組GAD以及高效率、低成本、酶法生產具有多種應用價值的GABA方法很少見報道。本研究的結果如下：l、以EcoliK12全基因組DNA為模板進行PCR反應，將擴增出的gadA基因片斷和載體pET28a連接構建重組質粒pET28agadA，將重組質粒pET28agadA轉化至EcoliBL21中，構建重組表達菌，用IPTG和乳糖對重組菌進行誘導，表達出大量分子量為53KDa左右的重組蛋白，而且重組蛋白占到全菌蛋白的70％75％左右，且

5、可溶性高。2、優(yōu)化了重組GAD粗酶液催化L谷氨酸鈉合成GABA的反應條件。lmL反應體系(含31g／L谷氨酸鈉，115U粗酶液，pH38)于37℃反應4h，GABA的生成量達到1957g／L，L谷氨酸鈉的轉化率為93％，從而為GABA的小試生產提供了很好的前景。3、研究了大腸桿菌GAD的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)及二價陽離子對其酶活的影響。研究表明：015mMPLP能使酶活提高約一倍，在pH38，06mMCa寸、75mMMn2對酶活有顯著

6、提高作用(相對酶活分別為174％，164％)，但兩者共效應表現(xiàn)為拮抗效應。Ca寸、M112的激活效應明顯大于其它七種陽離子，激活效應PLPCa：沖Mn2。推測EcoliGAD是一個PLPdependent，可能也是一種Ca2／CaM結合蛋白，能夠被PLP和Ca寸激活。1L放大反應體系中，加入30mL粗GAD(12U／mL)，015mMPLP，O6mMCa2轉化150g底物谷氨酸(底物采取分批添加方式)，24h反應轉化率達到90％以上，結