橙皮素衍生物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的治療作用及部分機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis, HF）是在各種慢性損傷的情況下發(fā)生的持續(xù)性病理性損傷-修復(fù)過(guò)程，可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)異常沉積，進(jìn)而引發(fā)肝臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終可引起肝硬化甚至肝癌。對(duì)于肝纖維化目前還沒(méi)有好的治療藥物和手段。研究表明，異常沉積的 ECM的主要來(lái)源之一是活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，HSC的活化增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生

2、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，這一過(guò)程可受到多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。通過(guò)抑制HSC的活化和增殖可以有效的抑制肝纖維化并達(dá)到治療肝纖維化的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素衍生物7號(hào)化合物（HDND-7）可通過(guò)抑制HSC活化增殖而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。橙皮素（hesperitin）來(lái)源于蕓香科柑橘屬果實(shí)的果皮，是一類(lèi)天然的黃酮類(lèi)化合物。有文獻(xiàn)報(bào)道，橙皮素具有抗炎，抗腫瘤，抗過(guò)敏以及抗氧化等生物活性。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)橙皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾合成

3、了一系列的衍生物，其中的橙皮素衍生物11號(hào)化合物（HD-11）對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6的增殖具有明顯的抑制作用，但HD-11是否具有抗肝纖維化的作用尚不明確；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，HD-11可促進(jìn)PTEN的表達(dá)。大量文獻(xiàn)報(bào)道，第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）在各種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等生理過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。PTEN作為一種抑癌基因，其合成的蛋白質(zhì)廣泛參與了人類(lèi)各種癌細(xì)胞的增殖，如乳腺癌，直腸癌，

4、肝癌等。此外，PTEN在其他疾病中的作用已被人們發(fā)現(xiàn)，如肝纖維化，肥胖，自身免疫性疾病等。前期研究還發(fā)現(xiàn)PTEN在肝纖維化過(guò)程中表達(dá)被抑制，升高PTEN能夠抑制α-SMA和col1α1等肝纖維化指標(biāo)的表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，AKT作為PTEN的直接下游靶點(diǎn)，激活后可通過(guò)各種信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖和凋亡。鑒于PTEN在細(xì)胞活化和增殖中的重要作用，提示HD-11的抗肝纖維化的作用可能是通過(guò)PTEN/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。以上內(nèi)容還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，

5、因此本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究橙皮素衍生物對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的治療作用及部分機(jī)制。本課題分為以下幾個(gè)部分：
　　1. HD-11對(duì)大鼠肝纖維化的作用
　　Sprague-Dawlay（SD）大鼠（雄性，180-220g）隨機(jī)分為正常組，模型組，低、中、高劑量組，每組8只。模型組大鼠皮下注射40%CCl4以建立肝纖維化模型，每周2次，共12周；給藥組為在造模8周時(shí)給予灌胃低、中、高劑量的HD-11，每周2次，共4周；正常對(duì)照組則

6、以同樣的方法注射等劑量橄欖油。為了確定各組肝組織的損傷和纖維化程度，用 HE、Masson染色及免疫組化進(jìn)行肝組織的病理學(xué)組織檢查；ALT和AST試劑盒檢測(cè)肝損傷指標(biāo)ALT、AST的水平；用 Western blot和RT-PCR檢測(cè)α-SMA, collagen I（col1α1）在肝纖維化大鼠肝組織和原代肝星狀細(xì)胞中的蛋白和mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HD-11對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有一定的治療作用。
　　2. H

7、D-11對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）的活化和增殖的影響
　　首先用 MTT法檢測(cè)不同濃度的 HD-11(0,1.25,2.5,5,10μM)對(duì) HSC-T6細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響，從而判斷 HD-11對(duì) HSC-T6細(xì)胞的細(xì)胞毒性；再用TGF-β1(10ng/ml)和不同濃度的 HD-11(0,1.25,2.5,5,10μM)作用細(xì)胞48h，采用MTT法篩選出最小的對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的濃度。采取 MTT方法和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)HD-1

8、1對(duì) HSC-T6細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。Western blot和 RT-PCR檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、col1α1的表達(dá)水平。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HD-11能夠明顯抑制 HSC-T6的活化和增殖并將其阻滯在G1期，而對(duì)細(xì)胞的凋亡沒(méi)有影響。
　　3. HD-11對(duì)PTEN/AKT信號(hào)通路的作用
　　在體實(shí)驗(yàn)，采用免疫組化檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中PTEN的表達(dá)；運(yùn)用Western blot和 RT-PCR分別檢測(cè)大鼠肝

9、組織和原代肝星狀細(xì)胞中的 PTEN在蛋白和mRNA水平的表達(dá)情況。離體實(shí)驗(yàn)，同時(shí)給予 TGF-β1(10ng/ml)和不同濃度的HD-11處理HSC-T6細(xì)胞48h，分別應(yīng)用免疫熒光、Western blot和 RT-PCR檢測(cè)PTEN在HSC-T6細(xì)胞上的表達(dá)變化。在HSC-T6細(xì)胞上分別采用PTEN的特異性抑制劑bpv、PTEN-siRNA和GV141-PTEN對(duì)PTEN進(jìn)行沉默和過(guò)表達(dá)，此時(shí)，運(yùn)用Western blot和 RT-

10、PCR檢測(cè)PTEN、α-SMA和col1α1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：HD-11能夠使PTEN的表達(dá)上調(diào)；當(dāng)PTEN被沉默或過(guò)表達(dá)時(shí)，α-SMA和col1α1的表達(dá)都上調(diào)或下調(diào)，而在 PTEN被沉默或過(guò)表達(dá)的基礎(chǔ)上再給予HD-11刺激，α-SMA和col1α1的表達(dá)均沒(méi)有發(fā)生明顯變化。
　　在體實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè) p-AKT在大鼠肝組織中的表達(dá)變化，采用Western blot技術(shù)分別檢測(cè)大鼠肝組織和原代肝

11、星狀細(xì)胞中 p-AKT、cyclinD1和c-myc的表達(dá)變化；離體實(shí)驗(yàn)，首先，同時(shí)給予 TGF-β1(10 ng/ml)和不同濃度的HD-11處理HSC-T6細(xì)胞48h，Western blot檢測(cè)p-AKT、cyclinD1和c-myc的表達(dá)變化。然后，采用相同方法沉默或過(guò)表達(dá) PTEN，分別運(yùn)用 Western blot和RT-PCR檢測(cè)p-AKT、cyclinD1和c-myc的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：組織和細(xì)胞中的p-AKT的表達(dá)被