7--酮基膽甾醇壬二酸單酯對巨噬細胞膽固醇轉運的調控作用.pdf

1、動脈粥樣硬化作為心腦血管疾病的病理學基礎，已成為導致人類死亡的主要原因。由氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein， oxLDL）驅動的巨噬細胞泡沫化在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中發(fā)揮了關鍵作用。研究顯示，清道夫受體CD36及血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)密切參與并調控了巨噬

2、細胞泡沫化的形成，因此研究二者與oxLDL的相互作用關系，并闡明該作用對膽固醇轉運過程的調控機制，對預防和治療動脈粥樣硬化具有重要的意義。在前期研究中，從oxLDL脂類提取物中分離得到一種新型表位結構—7-酮基膽甾醇壬二酸單酯（7-ketocholesteryl carboxynonanoate，oxLig-1），并推測oxLig-1很可能介導了oxLDL與清道夫受體CD36、LOX-1的結合作用，從而調控了巨噬細胞對oxLDL的攝取及

3、轉運過程。為了進一步明確oxLDL誘導巨噬細胞泡沫化形成的作用機制，本論文以oxLig-1、CD36及LOX-1為研究對象，主要從以下幾個方面展開了研究。
　　首先通過分子對接模擬、酶聯(lián)免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)以及表面等離子體共振技術(Surface plasmon resonance，SPR)分別對oxLig-1與CD36、LOX-1的結合作用加以研究，結果發(fā)現(xiàn)o

4、xLig-1作為表位結構介導了oxLDL與清道夫受體CD36、LOX-1的結合作用，并且該結合作用表現(xiàn)出高度的結合親和性。隨后分別對oxLig-1的各亞結構組份以及甲基化修飾物進行分析后發(fā)現(xiàn)，oxLig-1的疏水核心結構為結合作用提供了疏水作用，而ω-COOH則是結合過程中的主要位點，為結合構象的穩(wěn)定和結合作用的加固發(fā)揮了關鍵作用。
　　其次借助慢病毒介導的基因沉默技術分別構建得到CD36及LOX-1穩(wěn)轉基因沉默巨噬細胞株，并以此

5、為模型在細胞水平驗證了oxLig-1與CD36、LOX-1的結合作用。隨后利用基因沉默細胞模型以及激光共聚焦技術分析了CD36介導oxLDL吞噬的具體機制。結果顯示，oxLig-1可在細胞膜表面同CD36以及Caveolin-1發(fā)生共定位，同時oxLig-1及oxLDL的刺激作用可誘導Caveolin-1發(fā)生膜向移位以及聚集。與之相比oxLig-1的甲基化修飾物(me-oxLig-1)未表現(xiàn)出此作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1

6、構成的脂筏結構密切參與了巨噬細胞吞噬攝取oxLDL的過程，而CD36及Caveolin-1的基因沉默均大幅減少了膽固醇在細胞中的積累，表明CD36在與oxLDL表位結構oxLig-1結合后，能夠啟動Caveolin-1脂筏的形成，并通過此方式介導了oxLDL的吞噬和攝取作用。
　　再次研究了oxLig-1與CD36的結合作用對Caveolin-1蛋白表達的影響及相關調控機制。免疫共沉淀、基因沉默及抑制劑干預實驗結果顯示，oxLig

7、-1與CD36結合作用在啟動脂筏形成以及oxLDL吞噬攝取作用的同時，能夠激活CD36下游Src-JNK/ERK信號傳導通路，導致核轉錄因子NF-κB被活化，進而上調了Caveolin-1的蛋白表達，最終進一步加速了Caveolin-1脂筏的形成以及oxLDL的吞噬攝取作用。
　　最后評價了LOX-1在巨噬細胞膽固醇轉運過程中的作用。結果發(fā)現(xiàn)，LOX-1基因沉默明顯增強了巨噬細胞膽固醇蓄積作用。Western blot實驗結果顯示

8、，oxLDL以及oxLig-1的刺激作用可通過濃度和作用時間依賴的方式上調ABCA1(ATP bindingcassette transporter A1)的蛋白表達，而oxLig-1的甲基化修飾和LOX-1蛋白表達缺失均能夠抑制此上調作用。進一步的報告基因及抑制劑干預實驗結果表明，oxLDL在啟動巨噬細胞泡沫化的同時，還可通過其表位配體oxLig-1與LOX-1的結合作用誘導核轉錄因子PPARγ(Peroxisome prolifer