堿性蛋白酶抑制劑LupI-MSSS的原核表達、純化及晶體條件初篩.pdf

1、沙雷氏蛋白酶基因在產生該酶基因的菌株基因組中都有一個抑制該蛋白酶活性的基因位于其上游或者下游。低溫堿性金屬蛋白酶MP是從菌株YS-80-122中提取純化的，屬于沙雷氏蛋白酶家族，與該家族報道的其他酶的結構類似，氨基酸同源性最高為83％。在MP基因下游有一抑制劑基因lupI，與現有假單胞桿菌蛋白酶抑制劑APRin的氨基酸同源性為55%，該抑制劑可以完全抑制蛋白酶MP的活性。為進一步探究N端序列延伸后對抑制劑活性的影響，在野生型抑制劑基因的

2、基礎上，通過定點突變將LupI的N端增加Met-Ser-Ser-Ser，本實驗對抑制劑基因lupI-MSSS在大腸桿菌中進行了表達；并通過單因素法和響應面法相結合對該抑制劑的發(fā)酵表達條件進行了優(yōu)化；同時對表達后的蛋白進行了純化以滿足后續(xù)結晶的純度要求；最后對抑制劑LupI-MSSS的結晶條件進行了初篩，研究結果分述如下：
　　抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中的表達：利用定點突變試劑盒設計合成兩端引物，以 LupI野生型表達質粒

3、 pET28-lupI為模板，進行 PCR擴增，構建pET28a-lupI-MSSS原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行培養(yǎng)。挑選陽性單克隆進行雙酶切驗證，酶切后表達片段約為363 bp，與預期一致。將表達正確的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，擴大培養(yǎng)，并進行誘導表達。菌液重懸破碎后留上清，SDS-PAGE凝膠電泳結果表明該蛋白的大小約11 KDa，與預測的蛋白分子質量相同，同時活性測定也表明表達的該抑制劑可以完全

4、抑制堿性蛋白酶MP的活性。
　　抑制劑LupI-MSSS在大腸桿菌中表達條件優(yōu)化：采用單因素試驗對重組大腸桿菌表達抑制劑LupI-MSSS的培養(yǎng)誘導條件（初始培養(yǎng)基pH、接種量、誘導劑添加時間、誘導劑終濃度、誘導時間、誘導溫度、搖床轉速）進行了優(yōu)化，并針對以上七個因素，利用Plackett-Burman試驗篩選出3個主要影響因子：誘導劑添加時間、誘導劑終濃度、誘導時間。利用響應面試驗對以上三個主要因素進行了優(yōu)化，最終確定的發(fā)酵表達

5、條件為：初始培養(yǎng)基pH為7，接種量2%，誘導劑添加時間2 h，誘導劑IPTG終濃度0.5 mmol/L，誘導溫度為37℃，誘導時間為8.5 h，搖床轉速為200 r/min。
　　抑制劑LupI-MSSS的純化：發(fā)酵制備抑制劑粗蛋白液，經過三步純化：超濾、Superdex200凝膠過濾層析和Q-Sepharose離子交換層析。最終純化得到的樣品純化倍數為20，回收率為60.7%，SDS-PAGE電泳結果顯示為單一的目的條帶。通過H

6、PLC法對蛋白樣品的純度進行鑒定，其純度高達99.7%，達到預期要求，可供后續(xù)結晶試驗使用。
　　抑制劑LupI-MSSS結晶條件初篩：利用Hampton Research的試劑盒對抑制劑LupI-MSSS的晶體生長條件進行了初篩。HR2-144 Index試劑盒，20℃培養(yǎng)發(fā)現其中22個條件下都有晶體生長，且晶型較一致。挑取狀態(tài)較好的單晶進行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現有目的條帶存在，說明顯微鏡下觀察到的晶體確實為抑制劑蛋白結