大豆依賴RNA的RNA聚合酶基因GmRDR6a、GmRDR6b以及GmRDR1的克隆及表達(dá)特性分析.pdf

1、植物中依賴RNA的RNA聚合酶(RDRs)是個大家族，主要通過基因沉默途徑參與植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)、逆境表達(dá)以及表觀遺傳修飾等多種生物學(xué)過程，而依賴RNA的RNA聚合酶6(RDR6)及依賴RNA的RNA聚合酶1(RDR1)是其家族中的重要組分，已經(jīng)被鑒定出來具有獨(dú)特的功能。本研究從大豆中分離出了兩個RDR6基因和一個RDR1基因，分別被命名為GmRDR6a、GmRDR6b以及GmRDR1基因，通過對這三個基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及基因

2、表達(dá)特性分析，初步判斷其功能，以期為這些基因的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究利用同源克隆的方法從大豆品種‘科豐一號’中分離出2個RDR6基因，分別將其命名為GmRDR6a和GmRDR6b基因，并對其進(jìn)行序列分析，植物組織表達(dá)分析、抗逆境脅迫表達(dá)分析、亞細(xì)胞定位分析及構(gòu)建植物過量表達(dá)載體。結(jié)果表明GmRDR6a基因位于大豆基因組的6號染色體上，基因全長為4389 bp，包含一個長度為744 bp的內(nèi)含子，其ORF長度為3615bp

3、，編碼1204個氨基酸，相對分子量和等電點(diǎn)分別為297.5103和4.86; GmRDR6b基因位于大豆基因組的4號染色體上，基因全長為4002 bp，包含一個長度為387 bp的內(nèi)含子，其ORF長度為3615 bp，編碼1204個氨基酸，相對分子量和等電點(diǎn)分別為296.89103和4.86; GmRDR6a和GmRDR6b都含有RDRs家族的保守序列‘DLDGD’;2個基因在所有被檢測組織中均表達(dá)，并且在花中的表達(dá)量最高;熒光定量結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn):在大豆花葉病毒(Soybean MosaicVirus，SMV)處理下，2個基因在抗病材料‘科豐一號’中的表達(dá)量均顯著高于感病材料‘南農(nóng)1138-2’，在非生物脅迫下，GmRDR6a基因在鹽、干旱處理下根、莖、葉組織中的表達(dá)量均提高，其中鹽處理下根中的表達(dá)量最高，ABA誘導(dǎo)條件下出現(xiàn)早期響應(yīng)，冷害處理下該基因的表達(dá)量沒有明顯變化;GmRDR6b基因在鹽、ABA處理下，表達(dá)量很高，冷害處理下出現(xiàn)早期響應(yīng)，在干旱條件下，該基因表達(dá)趨勢

5、不明顯;因此，判斷這兩個基因參與大豆抗性反應(yīng)，其抗性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。構(gòu)建這兩個基因的融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)這兩個基因均定位在細(xì)胞核上，可見其主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能;分別構(gòu)建這兩個基因的過量表達(dá)載體pMDC83-GmRDR6a以及pMDC83-GmRDR6b，為探究GmRDR6a和GmRDR6b基因在大豆抗病中的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)。
　　另外本研究從大豆品種‘科豐一號’中分離出1個新的G

6、mRDR1基因，并對其進(jìn)行序列分析、組織表達(dá)分析、抗逆境脅迫表達(dá)分析及該基因的亞細(xì)胞定位和過量表達(dá)載體構(gòu)建研究。試驗后發(fā)現(xiàn)GmRDR1基因位于大豆基因組的2號染色體上，該基因全長為3956 bp，其中ORF為3378 bp，編碼1125個氨基酸，相對分子量和等電點(diǎn)分別為279.72103和4.63;GmRDR1含有RDRs家族的保守序列‘DLDGD’;該基因在所有被檢測組織中均表達(dá)，并且在葉中的表達(dá)量最高;熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn):在大豆花葉病

7、毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)處理下，GmRDR1在抗病材料‘科豐一號’中的表達(dá)量顯著高于感病材料‘南農(nóng)1138-2’，鹽脅迫條件下，該基因在莖、葉中的表達(dá)量明顯升高，且在24 h表達(dá)量達(dá)到最高值;該基因在根中的表達(dá)量6h出現(xiàn)短暫升高，而后表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢，干旱脅迫處理后48 h之內(nèi)，GmRDR1基因在根、莖、葉中的表達(dá)量均升高，在根、莖、葉中分別于6h、48 h、24 h表達(dá)量達(dá)到最高，該基因在莖中的表達(dá)量呈