鼠傷寒沙門氏菌菌毛FimA與PefA蛋白的原核表達(dá)及純化.pdf

1、沙門氏菌病又名副傷寒。有些沙門氏菌血清型可以引起牛沙門氏菌病。目前由于抗生素的長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性普遍存在，不僅影響該病的防治，更對(duì)公共衛(wèi)生造成威脅。隨著規(guī)模化、集約化舍飼養(yǎng)牛方式的不斷發(fā)展，牛沙門氏菌病成為阻礙其健康發(fā)展和影響食品安全的一個(gè)因素。
　　沙門氏菌Ⅰ型菌毛無論是在菌毛裝配上還是在基因、氨基酸序列方面，都較為保守。fimA是編碼Ⅰ型菌毛主要的菌毛亞單位。菌毛Pef具有良好的特異性。pefA為其主要的菌毛亞單位。本

2、試驗(yàn)通過傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)寧夏地區(qū)牛源沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定并確定了沙門氏菌的優(yōu)勢(shì)血清型;然后探索四對(duì)特異性引物用于PCR快速檢測(cè)的可行性;最后利用原核表達(dá)的方法得到純化的鼠傷寒沙門氏菌上述兩種菌毛主要亞單位蛋白，以期望在后續(xù)的抗原性分析、診斷以及預(yù)防鼠傷寒沙門氏菌病提供參考依據(jù)?；谏鲜鲅芯?jī)?nèi)容作了以下三個(gè)方面的工作:
　　1寧夏地區(qū)牛源沙門氏菌的分離鑒定
　　為了分析寧夏地區(qū)引起奶牛臨床乳房炎、隱性乳房炎、犢牛腹瀉、成母牛流產(chǎn)

3、的病原體。本試驗(yàn)通過采集病料，利用一系列微生物診斷方法和分子生物學(xué)方法對(duì)樣品中沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明四種特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期一致，可以用于后續(xù)沙門氏菌PCR快速檢測(cè)的建立。627份病牛樣品中有33份鑒定為沙門氏菌，分離率為5.26％。乳樣中檢出7種沙門氏菌血清型，組織樣中檢出2種沙門氏菌血清型，均為我國(guó)常見血清型。其中鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，其次為紐波特沙門氏菌。
　　2鼠傷寒沙門氏菌菌毛FimA、PefA蛋

4、白的原核表達(dá)
　　為了獲得鼠傷寒沙門氏菌菌毛FimA、PefA的重組蛋白。本階段試驗(yàn)首先對(duì)兩種菌毛亞單位進(jìn)行B細(xì)胞表位分析，設(shè)計(jì)并合成引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。利用T4連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，并對(duì)誘導(dǎo)條件（IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化。最后利用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果表明兩種重組載體全部構(gòu)建成功，重組蛋白全部表達(dá)。兩種重組蛋白FimA、PefA相對(duì)分子質(zhì)量分別約為36

5、kDa、33kDa且與預(yù)期一致，說明表達(dá)的蛋白是目的蛋白。重組蛋白FimA和PefA在大腸桿菌內(nèi)部積累，F(xiàn)imA蛋白主要以包涵體形式存在，而PefA蛋白主要以可溶形式存在。
　　3菌毛亞單位蛋白FimA、PefA的純化
　　為了進(jìn)行后續(xù)的抗原性分析需要純化的重組蛋白FimA、PefA。利用Ni-Agarose Resin分離純化FimA、PefA重組蛋白。利用Western blot對(duì)純化的FimA、PefA重組蛋白進(jìn)行分析