基于SELEX的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)DNA核酸適體篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor,EGFR）是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長(zhǎng)因子受體（Human EGF receptor,HER）家族成員之一，屬于I型跨膜酪氨酸激酶受體。廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面。EGFR在生理?xiàng)l件下，其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及細(xì)胞形態(tài)在組織生長(zhǎng)及發(fā)育過(guò)程中起重要作用。然而，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常

2、表達(dá)，如膠質(zhì)瘤、皮膚癌、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌。此外，EGFR過(guò)度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。EGFR高表達(dá)還與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放療耐受性有關(guān)，抑制EGFR可以增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放療敏感性。因此，EGFR已成為研究重要的靶點(diǎn)之一。目前抗EGFR的藥物包括 EGFR單克隆抗體西妥昔單抗（Cetuximab）及蛋白激酶抑制劑吉非替尼（Gefitinib）。由于兩者均屬于蛋白類，其化學(xué)修飾困難及強(qiáng)

3、免疫原性，限制其使用及效果。核酸適體是經(jīng)配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)的寡聚核苷酸片段，具有比抗體更好的化學(xué)性質(zhì)，與各種大小分子具有高選擇性和高親和力，此外，還具有無(wú)毒性、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，這使得在蛋白質(zhì)研究中顯示出很好的作用，特別是在檢測(cè)腫瘤生物標(biāo)志物研究中。通過(guò)SELEX技術(shù)可

4、以簡(jiǎn)便且快速獲得高特異性及高親和力的核酸適體，在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療方面顯示出巨大的應(yīng)用前景。目前血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）核酸適體作為藥物已經(jīng)過(guò)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，治療年齡相關(guān)性黃斑變性。EGFR RNA核酸適體已篩選出，但由于RNA核酸適體很容易被核酸酶降解，及篩選過(guò)程復(fù)雜及費(fèi)用昂貴，限制其使用。而DNA核酸適體具體穩(wěn)定、不易被核酸酶降解、易于合成、費(fèi)用低廉、易儲(chǔ)存的特點(diǎn)，更具有更廣闊的應(yīng)用空間。本實(shí)驗(yàn)組選擇單鏈D

5、NA核苷酸作為初始庫(kù)進(jìn)行EGFR核酸適體的篩選。
　　本文用重組EGFR（胞外區(qū)）為靶蛋白，Ni磁珠作為反篩蛋白，以76個(gè)堿基隨機(jī)單鏈DNA寡核苷酸庫(kù)作為初始庫(kù)，經(jīng)過(guò)11輪篩選，獲得22條與靶蛋白EGFR-磁珠高特異性和高親和力的DNA核酸適體。對(duì)第11輪庫(kù)進(jìn)行解離常數(shù)（Kd）的測(cè)定，測(cè)得Kd=107±26 nM，而對(duì)照初始庫(kù)與靶蛋白基本不結(jié)合。其中，選擇其中一條核酸適體命名為T(mén)uTu22，并將篩選出的核酸適體TuTu22與EGF