31193.海南特色動物cdna文庫構建及文庫篩選_第1頁
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文檔簡介

1、華中師范大學碩士學位論文海南特色動物cDNA文庫構建及文庫篩選姓名：申明霞申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：祁超王鳳陽20090501碩士學位論文MASTER‘STHESISAbstractAcDNAlibraryfromtheperipheralbloodleucocytesinCervuseldihainanaus，Bostaurushainanaus，WuzhishanMiniaturePigwasconstr

2、ucted誦mtheSMART(switchingmechanismat5endofRNAtranscript)techniqueThetotalRNAWasextractedfromtheperipheralbloodleucocytesandreverselytranscriptedintothefull—lengthcDNAbyusingPowerscriptTMreversetmnscriptasethedoublestrand

3、eDNAWassynthesizedandamplifiedbylong—distancePCR(LD—PCR)ThePCRproductsweredigestedbyproteinaseICAfterdigestion謝m肼，andsizefractionationusingCHROMASPIN400TMcolumns，thecDNAs(500bp)wereligatedtothestirdigesteddephosphorylate

4、dpDNR—LIBvectorsTheligationmixturewastransformedintoEcoliDH5abyelectroporationThen，thelibraryWasamplifiedandthecloneswerepickedrandomlyfromthelibraryforscreeningthesizeofeDNAinsertsTheprimaryconstructedeDNAlibrariesconta

5、ined19x106，12x106，15x106independentclonesThetitersoftheeDNAlibrarieswereestimatedas159x1010cfu／mL，3x109cfu／mL，97x109cfu／mLwithalmost100％thepercentageoftherecombinantclones，respectivelyandthoseoftheamplifiedlibrarieswere7

6、4x1012cfu／mL，43x10locfu／mL，64x10iocfu／mE，respectivelyTheresultsshowedthattheinsertsvariedfrom05to20kbwiththeaveragesizeWaslargerthan1100bp，whichindicatedthatthelibrariesbuiltsetupastrongbasisforscreeningthefull—lengthcDN

7、AsThesedatashowedthatthelibrariesmeettherequirementofastandardcDNAlibraryTheCervuseldihainanaus，Bostaurushainanaus，WuzhishanMiniaturePigeDNAlibrariesfromtheperipheralbloodleucocytesconstructedcouldlayabasisforsubsequentw

8、orkofcloningandselectingofsomekindsoffinefunctionalgenesAfull—lengthPMSA6geneeDNAWasclonedfromtheeDNAlibraryoftheperipheralbloodleucocytesinWuzhishanMiniaturePigbyColonyPCRThebioinformaticanalysisshowedthatthePMSA6eDNAse

9、quenceis1029bplength，containinganopenreadingframeof741bp，flankedby97bp5UTRand192bpYUTR，encoding246aminoacidsTherelativemolecularweightis37680kDapI876FurtheranalysisindicatedthattheexpressionsequenceofPMSA6andtheproteinen

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