dna測(cè)序原理和方法

1、DNA測(cè)序原理和方法DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序，手工測(cè)序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和MaxamGilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國(guó)PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測(cè)序儀，其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用最多的一種型號(hào)。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABIPRISM310型DNA測(cè)序儀的測(cè)序原理和操作規(guī)程?！驹怼緼BIPRISM310型基因分析儀(即

2、DNA測(cè)序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專(zhuān)利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過(guò)單引物PCR測(cè)序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測(cè)序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過(guò)毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測(cè)器窗口中的

3、CCD(gecoupleddevice)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測(cè)定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠

4、高分子聚合物，包括DNA測(cè)序膠(POP6)和GeneScan膠(POP4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對(duì)測(cè)序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運(yùn)行等軟件。它使用最新的CCD攝影機(jī)檢測(cè)器，使DNA測(cè)序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。由于該儀器具有DNA測(cè)序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DN

5、A測(cè)序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長(zhǎng)片段PCR、RTPCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測(cè)、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等?！驹噭┡c器材】1BigDye測(cè)序反應(yīng)試劑盒主要試劑是BigDyeMix，內(nèi)含PE專(zhuān)利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反應(yīng)

6、緩沖液等。2pGEM3Zf()雙鏈DNA對(duì)照模板0.2gL，試劑盒配套試劑。3M13(21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmolL，即3.2pmolμl，試劑盒配套試劑。4DNA測(cè)序模板可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2gL，即200ngμl。5引物需根據(jù)所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2μmolL，即3.2p

7、molμl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(21)引物，T7引物等。6滅菌去離子水或三蒸水。70.2ml或和0.5ml的PCR管蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。83molL醋酸鈉(pH5.2)稱(chēng)取40.8gNaAc3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。970%乙醇和無(wú)水乙醇。10NaAc乙醇混合液取37.5ml無(wú)水乙醇和2.5ml3molLNaAc混勻，室溫可保存1年。11PO

8、P6測(cè)序膠ABI產(chǎn)品。12模板抑制試劑(TSR)ABI產(chǎn)品。1310電泳緩沖液ABI產(chǎn)品。100ng，雙鏈DNA需200～500ng，DNA的純度一般是A260nmA280nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmolμl較好。4本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒是BigDye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒，一般可測(cè)DNA長(zhǎng)度為650bp左右。本儀器DNA測(cè)序精確度為(98.50