內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的微囊藻毒素致斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的研究.pdf

1、水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的藍(lán)藻水華已成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的環(huán)境問題，多種藻毒素的產(chǎn)生是潛在危害之一，尤以微囊藻毒素為最常見。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素（Microcystin-leucine-arginine，MC-LR）對(duì)斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性及誘導(dǎo)凋亡，但是潛在的分子機(jī)制相關(guān)研究還非常匱乏。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾、折疊的場(chǎng)所是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊的或錯(cuò)誤折疊的蛋白及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的破壞將都會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulu

2、m stress，ERS）。嚴(yán)重且持續(xù)的ERS可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，已有研究證實(shí)，三丁基錫、金屬鎘、納米銀粒子以及二氧化硅納米材料對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行暴露均能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而，ERS是否參與了 MC-LR斑馬魚胚胎發(fā)育損傷及凋亡尚不明確。
　　本研究觀察 MC-LR對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的損傷效應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的活化，并采用?；撬嵝苊撗跄懰幔═auroursodeoxycholic acid，TUDCA）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑

3、制劑，觀察其對(duì)MC-LR誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的阻斷效應(yīng)，從而進(jìn)一步闡明 MC-LR暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的損傷及其介導(dǎo)機(jī)制。用不同濃度（0.5、1、2、4、6μM）MC-LR對(duì)斑馬魚胚胎暴露96 h，分析存活率、心率、畸形率和體長(zhǎng)等毒性終點(diǎn)指標(biāo)，選取適宜的斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的誘導(dǎo)濃度。然后用TUDCA作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑，進(jìn)行MC-LR致斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的保護(hù)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)存活率、心率、畸形率、體長(zhǎng)和體重等毒性終點(diǎn)指標(biāo)；用吖啶橙（AO）

4、染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平；Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.不同濃度（0.5、1、2、4、6μM）MC-LR對(duì)斑馬魚胚胎暴露96 h，斑馬魚胚胎/幼魚在各濃度的MC-LR暴露液中存活率沒有受到影響，但在MC-LR的濃度達(dá)到2μM時(shí)，顯著影響斑馬魚胚胎/幼魚的畸形率、心率，當(dāng)MC-LR濃度達(dá)到4μM時(shí)，斑馬魚幼

5、魚的體長(zhǎng)也被抑制。選取能導(dǎo)致畸形率、心率和體長(zhǎng)都受影響的4μM MC-LR濃度為斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的誘導(dǎo)濃度。TUDCA是常用的ERS抑制劑，單獨(dú)的TUDCA暴露實(shí)驗(yàn)顯示，TUDCA在濃度為1、2.5、5、10、20 uM時(shí)，不影響斑馬魚胚胎的死亡/畸形率，而當(dāng)濃度達(dá)40 uM時(shí)，斑馬魚胚胎的死亡/畸形率就顯著上升，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，TUDCA的濃度選擇為20 uM。
　　2. MC-LR處理后，斑馬魚畸形率從2.4±0.8％顯著

6、上升到4.5±1.0%，心率、體長(zhǎng)和體重也顯著下調(diào)，分別為148.6±4.8beats/min、3.60±0.04 mm、0.417±0.036mg；而在MC-LR處理中加入TUDCA的暴露組中，畸形率、心率、體長(zhǎng)和體重的異常都顯著地得到緩解。AO染色發(fā)現(xiàn)， MC-LR處理組的斑馬魚幼魚的心臟區(qū)域出現(xiàn)明顯的凋亡；而在MC-LR處理中加入TUDCA的暴露組中，斑馬魚幼魚的心臟區(qū)域的凋亡也有所抑制。
　　3.通過RT-PCR，我們發(fā)現(xiàn)

7、，MC-LR處理組的斑馬魚幼魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因eif2s-1, atf4b1, atf6, mapk8, chop, bax,bcl-2，p53, mdm2, caspase-8, caspase-9 mRNA的表達(dá)都不同程度的受到影響；而在MC-LR處理中加入TUDCA的暴露組中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)與MC-LR處理組相比都有所緩解。
　　4.Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，MC-LR處理組