內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的微囊藻毒素致斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的研究.pdf

1、水體富營養(yǎng)化導致的藍藻水華已成為國內(nèi)外關注的環(huán)境問題，多種藻毒素的產(chǎn)生是潛在危害之一，尤以微囊藻毒素為最常見。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)微囊藻毒素（Microcystin-leucine-arginine，MC-LR）對斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性及誘導凋亡，但是潛在的分子機制相關研究還非常匱乏。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾、折疊的場所是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊的或錯誤折疊的蛋白及細胞內(nèi)環(huán)境的破壞將都會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulu

2、m stress，ERS）。嚴重且持續(xù)的ERS可誘導細胞發(fā)生凋亡，已有研究證實，三丁基錫、金屬鎘、納米銀粒子以及二氧化硅納米材料對斑馬魚胚胎進行暴露均能誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。然而，ERS是否參與了 MC-LR斑馬魚胚胎發(fā)育損傷及凋亡尚不明確。
　　本研究觀察 MC-LR對斑馬魚胚胎發(fā)育的損傷效應，檢測細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑的活化，并采用?；撬嵝苊撗跄懰幔═auroursodeoxycholic acid，TUDCA）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抑

3、制劑，觀察其對MC-LR誘導的斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的阻斷效應，從而進一步闡明 MC-LR暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育的損傷及其介導機制。用不同濃度（0.5、1、2、4、6μM）MC-LR對斑馬魚胚胎暴露96 h，分析存活率、心率、畸形率和體長等毒性終點指標，選取適宜的斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的誘導濃度。然后用TUDCA作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑，進行MC-LR致斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的保護實驗，統(tǒng)計存活率、心率、畸形率、體長和體重等毒性終點指標；用吖啶橙（AO）

4、染色法檢測細胞凋亡；實時定量PCR（RT-PCR）檢測細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關基因的轉錄水平；Western blot技術檢測細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白表達。實驗結果如下：
　　1.不同濃度（0.5、1、2、4、6μM）MC-LR對斑馬魚胚胎暴露96 h，斑馬魚胚胎/幼魚在各濃度的MC-LR暴露液中存活率沒有受到影響，但在MC-LR的濃度達到2μM時，顯著影響斑馬魚胚胎/幼魚的畸形率、心率，當MC-LR濃度達到4μM時，斑馬魚幼

5、魚的體長也被抑制。選取能導致畸形率、心率和體長都受影響的4μM MC-LR濃度為斑馬魚胚胎發(fā)育損傷的誘導濃度。TUDCA是常用的ERS抑制劑，單獨的TUDCA暴露實驗顯示，TUDCA在濃度為1、2.5、5、10、20 uM時，不影響斑馬魚胚胎的死亡/畸形率，而當濃度達40 uM時，斑馬魚胚胎的死亡/畸形率就顯著上升，因此在后續(xù)實驗中，TUDCA的濃度選擇為20 uM。
　　2. MC-LR處理后，斑馬魚畸形率從2.4±0.8％顯著

6、上升到4.5±1.0%，心率、體長和體重也顯著下調(diào)，分別為148.6±4.8beats/min、3.60±0.04 mm、0.417±0.036mg；而在MC-LR處理中加入TUDCA的暴露組中，畸形率、心率、體長和體重的異常都顯著地得到緩解。AO染色發(fā)現(xiàn)， MC-LR處理組的斑馬魚幼魚的心臟區(qū)域出現(xiàn)明顯的凋亡；而在MC-LR處理中加入TUDCA的暴露組中，斑馬魚幼魚的心臟區(qū)域的凋亡也有所抑制。
　　3.通過RT-PCR，我們發(fā)現(xiàn)

7、，MC-LR處理組的斑馬魚幼魚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡相關基因eif2s-1, atf4b1, atf6, mapk8, chop, bax,bcl-2，p53, mdm2, caspase-8, caspase-9 mRNA的表達都不同程度的受到影響；而在MC-LR處理中加入TUDCA的暴露組中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡相關基因的異常表達與MC-LR處理組相比都有所緩解。
　　4.Western blot檢測顯示，與對照組相比，MC-LR處理組