內(nèi)外源性芳香烴類化合物對芳香烴受體的誘導(dǎo)效應(yīng)研究.pdf

1、芳香烴類化合物是自然界中廣泛存在的一類對人體健康有重要影響的物質(zhì)。芳香烴受體(AhR)是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，能夠被多種天然或化學(xué)合成的物質(zhì)激活，介導(dǎo)AhR配體的毒性效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)。AhR的活性是由配體調(diào)節(jié)的，為了探究AhR對其配體的應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩株重組細(xì)胞株。選取多種內(nèi)外源性芳香烴化合物對重組細(xì)胞進(jìn)行刺激，探究不同來源的配體對AhR的誘導(dǎo)效應(yīng)。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.重組細(xì)胞株Hepa1.6-pGl4.43和Hep

2、G2-pGl4.43的構(gòu)建及其穩(wěn)定株的篩選。實(shí)驗(yàn)利用質(zhì)粒pGl4.43[luc2P/XRE/Hygro]轉(zhuǎn)染鼠肝癌細(xì)胞Hepa1.6和人肝癌細(xì)胞HepG2，構(gòu)建了兩株受XRE應(yīng)答元調(diào)控的，以熒光素酶作為報(bào)告基因的重組細(xì)胞株，潮霉素B篩選濃度分別為800μg/mL和200μg/mL。結(jié)果證明，兩株重組細(xì)胞具有高靈敏性，較低濃度的TCDD(100 pM)、FICZ(10 nM)既能明顯引起熒光素酶的表達(dá)。
　　2.驗(yàn)證重組細(xì)胞對配體應(yīng)

3、答的準(zhǔn)確性。我們利用TCDD、FICZ刺激野生型鼠肝癌細(xì)胞Hepa1.6和人肝癌細(xì)胞HepG2，檢測細(xì)胞色素酶CYP A1，CYP1B1的表達(dá)量，結(jié)果與重組細(xì)胞株呈現(xiàn)相同的趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了應(yīng)答芳香烴類化合物的高靈敏細(xì)胞系，可以利用構(gòu)建的重組細(xì)胞系探究AhR對其配體的應(yīng)答。
　　3.探究AhR對其配體的應(yīng)答反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)利用構(gòu)建的重組細(xì)胞報(bào)告基因系統(tǒng)，篩選5種外源，7種食源，4種內(nèi)源性化合物，來確定他們對芳香烴受體的應(yīng)答。結(jié)

4、果顯示外源性配體和內(nèi)源性配體是AhR的激動劑。大部分的食源性配體濃度較低時(shí)能夠激活A(yù)hR，是AhR弱激動劑，但是在高濃度時(shí)，某些食源性配體具有抑制AhR的作用，是AhR拮抗劑。在重組鼠肝癌細(xì)胞的食源性配體與FICZ/TCDD共同作用實(shí)驗(yàn)證明，食源性配體協(xié)同F(xiàn)ICZ對AhR的作用;高濃度的3'，4'-DMF、QUE、RES、CUR抑制TCDD對AhR的作用，而API、DAI一直呈協(xié)同的趨勢。在重組人肝癌細(xì)胞的食源性配體與FICZ/TCDD

5、共同作用實(shí)驗(yàn)證明，低濃度的API、QUE、RES、CUR協(xié)同F(xiàn)ICZ/TCDD對AhR的作用而高濃度呈現(xiàn)拮抗趨勢;而DAI、3'，4'-DMF一直呈協(xié)同的趨勢。
　　4.驗(yàn)證食源性配體對細(xì)胞活性的抑制。用MTT比色法評估野生型細(xì)胞活力的抑制發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，對細(xì)胞活性抑制率逐漸增大，并且對人肝癌細(xì)胞的毒性明顯大于鼠肝癌細(xì)胞。
　　構(gòu)建以熒光素酶為報(bào)告基因的重組細(xì)胞具有靈敏、簡單、快速的特點(diǎn)，可以滿足本實(shí)驗(yàn)檢測芳香烴受體介