施用糞肥的設(shè)施菜地土壤中抗生素及抗性基因多樣性及豐度的研究.pdf

1、抗生素作為20世紀(jì)最重要的發(fā)現(xiàn)之一，在保障人類及動(dòng)物健康以及促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展方面起著不可替代的作用。然而，由于抗生素的誤用和濫用，使得大量的抗生素以原藥或代謝物的形式隨人或動(dòng)物體的排泄而進(jìn)入環(huán)境，導(dǎo)致環(huán)境中，特別是土壤環(huán)境和水環(huán)境中存在大量抗生素殘留，進(jìn)而增加了土壤或水環(huán)境中微生物的抗性壓力，加速了大量抗性微生物的產(chǎn)生?？剐晕⑸飳?duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因是其攜帶有各種抗生素抗性基因，因此，抗生素的大量使用直接或間接增加了環(huán)境中抗性

2、基因的含量。設(shè)施菜地是使用畜禽糞便較為頻繁的場(chǎng)所，因此，研究設(shè)施菜地土壤中抗生素含量、耐藥菌數(shù)量以及抗性基因的含量是十分必要的。
　　本研究采集了山東濰坊、泰安、濱州、東營(yíng)四個(gè)地區(qū)長(zhǎng)期使用糞肥的9個(gè)典型設(shè)施菜地土壤，研究了設(shè)施菜地土壤中抗生素及抗性基因含量等。本實(shí)驗(yàn)選取了四類抗生素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）以及高效液相色譜（High Performance Liquid Chro

3、matography，HPLC）檢測(cè)的方法，檢測(cè)了土壤樣品中三種抗生素的含量；另外，對(duì)土樣中含有的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了數(shù)量的統(tǒng)計(jì)及菌種的鑒定；選取了五類共12種抗性基因和可移動(dòng)遺傳元件（MGE）利用real-time qPCR定量檢測(cè)的方法對(duì)其豐度進(jìn)行了測(cè)定。最后，將抗性基因的含量與土樣理化性質(zhì)、抗生素含量、耐藥菌的數(shù)量以及MGE的含量進(jìn)行綜合分析。該論文的主要研究結(jié)果如下：
　　（1）在土壤樣品抗生素含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)力霉素在所有土

4、壤樣品中均有檢出，濃度范圍在52.37μg/kg~428.16μg/kg之間；磺胺二甲嘧啶除了在土樣S4中沒有檢出外，其他土樣中均有檢出，濃度范圍在14.12μg/kg~81.31μg/kg之間；泰樂菌素只在S0、S2、S3、S4和S8這5個(gè)土壤樣品中有檢出，濃度范圍為70.01μg/kg~482.36μg/kg。
　?。?）在可培養(yǎng)抗生素耐藥菌實(shí)驗(yàn)中，土樣中的耐藥菌對(duì)抗生素的耐藥性因抗生素種類和濃度的不同而在數(shù)量上呈現(xiàn)出較大差異

5、。在未使用過糞肥的土樣S0中，細(xì)菌對(duì)抗生素仍有一定的抗性存在，長(zhǎng)期使用糞肥的菜地土樣S1~ S9耐藥率要高于土樣S0。隨著抗生素濃度的增加，細(xì)菌耐藥率逐漸降低。土壤耐藥菌對(duì)四種抗生素的耐藥率大小依次為：磺胺二甲嘧啶>泰樂菌素>恩諾沙星>強(qiáng)力霉素。
　?。?）在抗生素耐藥菌分離鑒定實(shí)驗(yàn)中，共篩選出強(qiáng)力霉素耐藥菌12個(gè)屬，17個(gè)種，優(yōu)勢(shì)菌株為鏈霉菌屬；篩選出磺胺二甲嘧啶耐藥菌9個(gè)屬，16個(gè)種，優(yōu)勢(shì)耐藥菌為芽孢桿菌屬；篩選出恩諾沙星耐藥

6、菌9個(gè)屬，16個(gè)種，優(yōu)勢(shì)菌株為微桿菌屬；篩選出泰樂菌素耐藥菌9個(gè)屬，12個(gè)種，優(yōu)勢(shì)菌株為寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬。芽孢桿菌屬、金黃桿菌屬和假單胞菌屬屬于多重耐藥菌。
　　（4）在選取的五類共16種抗性基因中，tetW、tetM、tetO、sul1、sul2、qepA、qnrB、qnrS、ermB、ermF的檢出頻率均為100％。在定量實(shí)驗(yàn)中，各種抗性基因在不同土樣中的含量存在較大差異。四環(huán)素類抗性基因中，tetM的含量最高，磺胺類

7、抗性基因中sul2的含量較高，喹諾酮類抗性基因中，qepA的含量相對(duì)較高，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因中，ermF的含量相對(duì)較高?？梢苿?dòng)元件intI1的含量相對(duì)較高。各抗性基因總量關(guān)系為：磺胺類>大環(huán)內(nèi)酯類>四環(huán)素類>喹諾酮類。
　　（5）從土樣理化性質(zhì)方面分析，土樣pH值與恩諾沙星耐藥菌數(shù)量之間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，重金屬含量與喹諾酮類抗性基因qnr呈現(xiàn)極顯著相關(guān)；從抗生素含量角度分析，土樣中強(qiáng)力霉素含量與泰樂菌素的含量及磺胺類抗性基因的含量s