海洋貝類微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)和應(yīng)用【文獻綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　海洋貝類微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)和應(yīng)用</p><p>　　摘要：在海洋貝類育種中，常常缺乏對親本遺傳背景的了解以及對目標性狀可靠準確的早期的預(yù)選手段，造成了育種的盲目性大且效率低。微衛(wèi)星分子標記具有多態(tài)性

2、豐富、雜合子比例較高、信息含量較大、具保守性和共顯性等特點，是最理想的分析重要經(jīng)濟性狀的遺傳連鎖關(guān)系的標記之一。本文就海洋貝類的微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)和應(yīng)用方面進行了簡單的介紹。</p><p>　　關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星分子標記；原理；特點；研究進展；應(yīng)用</p><p>　　上世紀80年代以來，DNA分子標記的技術(shù)開始應(yīng)用在遺傳育種領(lǐng)域。在海洋貝類育種中，常常缺乏對親本遺傳背景的了解以及對目標性

3、狀可靠準確的早期的預(yù)選手段，造成了育種的盲目性大且效率低。而緊密連鎖的DNA標記為實現(xiàn)水產(chǎn)動物目標性狀的早期選擇提供了比較有效德途徑。因此，研究與海洋貝類重要經(jīng)濟性狀緊密連鎖的DNA標記，特別是對缺乏遺傳連鎖圖譜的海洋貝類DNA標記，就顯得十分重要。微衛(wèi)星分子標記具有多態(tài)性豐富、雜合子比例較高、信息含量較大、具保守性和共顯性等特點，是最理想的分析重要經(jīng)濟性狀的遺傳連鎖關(guān)系的標記之一[1]。</p><p>　　1

4、 微衛(wèi)星分子標記的原理</p><p>　　微衛(wèi)星DNA（Microsatellites DNA），又叫做短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeats，STRs）或者簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSRs），是由1~6個核苷酸作為核心序列[2]，首尾相互連接而形成的串聯(lián)重復(fù)序列，也是一種廣泛存在于真核生物基因組中的中度重復(fù)序列。</p><p>

5、　　微衛(wèi)星DNA在原核生物及真核生物基因組中廣泛存在，常見的有二、三、四核苷酸重復(fù)序列，約占真核生物基因組的5%。微衛(wèi)星DNA基本的構(gòu)成單位是2~6bp，其中位于編碼區(qū)附近的數(shù)量較多，也有位于內(nèi)含子、啟動子和Alu序列中的。微衛(wèi)星DNA的數(shù)目巨大，在人類基因組中就有約5×104~1×105個（CA）n重復(fù)序列，重復(fù)的次數(shù)一般為15至60次，重復(fù)的單位一樣，其長度一般小于200bp，但也有些長度較長的[3]。Beckm

6、ann和Weber等[4]許多科學(xué)家從微衛(wèi)星DNA的結(jié)構(gòu)特點出發(fā)并結(jié)合PCR技術(shù)，從而建立起了以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，檢測相當方便的微衛(wèi)星標記技術(shù)并獲得了廣泛的應(yīng)用。</p><p>　　在進行微衛(wèi)星分子標記時通常不會直接將微衛(wèi)星DNA作為探針，而是以互補于側(cè)翼序列的寡核苷酸作為引物，從而對DNA模板進行PCR擴增。側(cè)翼序列可使微衛(wèi)星特異性地定位至基因組中的某一位置，從而使其具有特異性，而群體中微衛(wèi)星其本身核心部分的

7、堿基重復(fù)數(shù)目的不一致導(dǎo)致微衛(wèi)星位點呈現(xiàn)多態(tài)性。如果兩側(cè)側(cè)翼序列所包含的微衛(wèi)星的單位數(shù)目是相同的，那么這個個體在該微衛(wèi)星上是純合的，不然便是雜合的?；蛐偷呐袛鄤t是以某個微衛(wèi)星的側(cè)翼序列為特異性引物，由不同個體基因組的總DNA作為模板進行PCR擴增，再對其擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并觀察有無特異性條帶。經(jīng)過對擴增產(chǎn)物大小的比較，便可檢測出每一個個體在不同微衛(wèi)星座位上的遺傳結(jié)構(gòu)[5]。</p><p>　　微衛(wèi)星

8、標記技術(shù)以其獨立的研究領(lǐng)域不斷地發(fā)展應(yīng)用，逐漸成為最具遺傳學(xué)家們重視的分子遺傳標記技術(shù)，水生生物學(xué)家們也開始使用此技術(shù)對水生生物進行更深入的研究[4]。</p><p>　　2 微衛(wèi)星分子標記的特點</p><p>　　由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR擴增等特點[6]，已成為最受學(xué)者們喜愛的一種分子生物學(xué)研究

9、方法。</p><p>　　2.1 豐富的多態(tài)性</p><p>　　與微衛(wèi)星多態(tài)性有關(guān)的統(tǒng)計量有3個，即全息交配率（PFIM）、雜合度（H）和多態(tài)信息含量（PIC）。微衛(wèi)星的信息含量比較大，具多態(tài)性（PIC≥0.7）且雜合子比例相對較高，因此應(yīng)用于基因定位連鎖分析時的效率也有所提高。Nei[7]等運用微衛(wèi)星資料來估計遺傳距離，對于系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建的精確性在計算機上做了模型后觀察得到結(jié)論：微

10、衛(wèi)星的多態(tài)性高于血型、蛋白質(zhì)多態(tài)性，由其計算得到的基因雜合度通常在0.3～0.8之間，因此他們認為，微衛(wèi)星運用在遺傳距離估測，尤其在親緣關(guān)系相近的種群間以及繪制系統(tǒng)樹時，可以的到更為精確、效率更高的結(jié)果。微衛(wèi)星DNA標記雖然往往只能探查單個座位，但由于其突變率非常低（在10-4～5×10-5之間），得以保證其在連鎖分析時保持高效性，是RFLP與RAPD所不及的。大多數(shù)RFLP呈現(xiàn)二態(tài)性，雜合率低（小于50%）并且信息含量也很低

11、，一般僅為0.2左右；而RAPD僅僅表現(xiàn)出顯性遺傳，不能夠直接區(qū)分開雜合子與純合子[5]。微衛(wèi)星DNA在基因組中的分布是隨機的，可在內(nèi)含子中存在，也可以出現(xiàn)于編碼區(qū)或者是染色體的其它區(qū)域內(nèi)。核心序列的重復(fù)次數(shù)可能在不同個體中是不同的，重復(fù)次數(shù)越多相</p><p>　　2.2 微衛(wèi)星標記的穩(wěn)定性</p><p>　　某一物種的微衛(wèi)星引物可與相關(guān)密切的物種中，生物基因組中的微衛(wèi)星DNA所在的

12、區(qū)域是比較保守的。Yang和Movre等[7]先后用牛的微衛(wèi)星引物研究羊、馬和人的基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在羊中56%的引物可擴增出特異性產(chǎn)物，其中有42%的擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)性，而馬和人的基因組中都沒有擴增多態(tài)性。許多研究結(jié)果證明了可用牛的微衛(wèi)星標記引物來構(gòu)建綿羊或山羊的遺傳基因圖譜，這就可以減少獲取微衛(wèi)星的工作量和加快基因組作圖的工作進度。</p><p>　　2.3 微衛(wèi)星位點的PCR擴增</p>&l

13、t;p>　　微衛(wèi)星序列的等位基因在500bp以內(nèi)范圍的渡動是較理想的，而用于PCR及凝膠電泳分析所需的就是這些位點上的多態(tài)性，也正由于微衛(wèi)星位點的PCR擴增，使得它在實際應(yīng)用上相對除RAPD外的其它方法有更多優(yōu)勢，比如：減少樣品使用量、擴大了樣品來源、引物的通用性等[7,9]。</p><p>　　微衛(wèi)星標記作為一種新型的標記方法，擁有許多的優(yōu)點，但也存在一些不足：在檢測微衛(wèi)星PCR擴增產(chǎn)物過程中，在聚丙烯

14、酰胺膠上常常會出現(xiàn)“影子帶”（硝酸銀染色）和波峰重疊（熒光自動測序儀）現(xiàn)象[1]，增加了判讀等位基因的難度，使研究結(jié)果產(chǎn)生一定偏差，需要進行更深入的研究以得到更精確的實驗結(jié)果。開發(fā)費時、成本高：開發(fā)某種生物的微衛(wèi)星標記是研究此種生物種群的先前條件。通過設(shè)計引物來檢測微衛(wèi)星的多態(tài)性，區(qū)域中的重復(fù)序列用PCR擴增，引物的長度雖然很短，但需獲得特異性強、擴增效率高的引物，微衛(wèi)星側(cè)翼區(qū)的堿基序列必須滿足若干條件。對于大部分動植物，由于缺乏DNA

15、信息的積累，需按照DNA抽提、文庫構(gòu)建、篩選、測序、引物設(shè)計的步驟開發(fā)微衛(wèi)星標記。這個過程至少需要1至2個月，與RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）和AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）標記開發(fā)相比時間花費得多。無效等位基因（null allele）的存在：無效等位基因是指不被PCR擴增的等位基因，常常是由引物結(jié)合部位的點突變、插入或缺失引起。由

16、于微衛(wèi)星序</p><p>　　3 海洋貝類微衛(wèi)星標記的開發(fā)</p><p>　　3.1 直接克隆獲得 </p><p>　　海洋貝類尤其是中國的很多養(yǎng)殖型海洋貝類在世界上是獨特的，只能由中國人自己來制備而這些種類的微衛(wèi)星標記，其中主要的獲得途徑是隨機克隆法及磁珠富集法，磁珠富集法相對而言得到的微衛(wèi)星更多。直接克隆主要是克隆基因組DNA的微衛(wèi)星，最近也有從cDNA文

17、庫中篩選微衛(wèi)星陽性克隆，經(jīng)測序獲得含微衛(wèi)星的序列[10]。</p><p>　　3.2 從網(wǎng)上公布的序列中獲得</p><p>　　DNA和cDNA序列在網(wǎng)上都有公布，可能搜索到含微衛(wèi)星的序列。DNA的微衛(wèi)星序列可以利用軟件設(shè)計引物，直接克隆序列即可。目前網(wǎng)上公布的cDNA序列比DNA序列要多，就價值而言，從cDNA序列中得到的多態(tài)性標記較高，但從cDNA制備微衛(wèi)星標記有兩個不足之處：一是

18、在多態(tài)性上cDNA含有的微衛(wèi)星序列遠遠低于DNA的[11]；此外，內(nèi)含子的存在使得cDNA序列所設(shè)計的引物有擴增不出預(yù)期產(chǎn)物的可能。</p><p>　　3.3 物種間同源轉(zhuǎn)移法</p><p>　　由于物種之間DNA序列同源性的存在，微衛(wèi)星DNA的側(cè)翼序列保守性較好，可以將已開發(fā)的一種物種的微衛(wèi)星引物使用在其他物種上。一般認為微衛(wèi)星引物在親緣關(guān)系相近的物種的通用性較好，Cui、Zhan和

19、Li等[2]用這種方法分別對櫛孔扇貝、海灣扇貝等進行了嘗試，得到的結(jié)果也較理想。</p><p>　　4 微衛(wèi)星標記在海洋貝類中的應(yīng)用及研究進展</p><p>　　4.1 微衛(wèi)星標記在海洋貝類中的應(yīng)用</p><p>　　在海洋生物中，微衛(wèi)星的研究已經(jīng)涉及到遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖的構(gòu)建、基因的定位與克隆、親權(quán)分析、品種鑒定、進化分析及分子生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域[12

20、]。</p><p>　　4.1.1 在遺傳多樣性上的研究應(yīng)用</p><p>　　海洋貝類遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究對種質(zhì)的搜集、保存以及在育種工作中的應(yīng)用具有相當重要的意義，可以為海洋貝類的遺傳改良和基因資源的利用提供科學(xué)依據(jù)[2]。戰(zhàn)愛斌[12]利用9個多態(tài)性微衛(wèi)星標記對選育體系中的基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳多樣性和遺傳分化分別進行了評價，分析結(jié)果表明：基礎(chǔ)群體的遺傳多樣性豐富，得到群

21、體的平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.6007和0.7212。Sato等[5]利用了4個微衛(wèi)星標記對分別取自日本北海道、本州和俄羅斯南Primorye的14個、3個和4個群體的766個個樣進行了分析。發(fā)現(xiàn)所有群體的遺傳多樣性均較高，3個地理區(qū)域的遺傳分化比較明顯，通過對20年樣本的分析，表明群體遺傳結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生與養(yǎng)殖原因基本無關(guān)。</p><p>　　4.1.2 家系分析和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建</p>

22、<p>　　生物體其基因功能的表達與調(diào)控都取決于基因組中所含堿基的排列順序和組成，基因圖譜的構(gòu)建不僅可以了解某個基因組的組織與結(jié)構(gòu)，還可以借助基因圖譜來鑒定和克隆對經(jīng)濟性狀產(chǎn)生影響的QTL，進一步研究并操縱一些重要的基因[13]。近年來持續(xù)發(fā)展的分子遺傳學(xué)提供了較理想的DNA分子標記來進行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，如RFLP和小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等。其中微衛(wèi)星因其高多態(tài)性、高雜合子比例和大含量的信息，還有保守性、共顯性等優(yōu)點，使得其引

23、物可以于不同實驗室之間進行交流，適于自動化或半自動化操作，是目前制作遺傳連鎖圖譜的主要標記之一[14]。</p><p>　　無效的等位基因和標記的非孟德爾遺傳在雙殼類中普遍存在，Zhan等構(gòu)建了4個自交家系對于海灣扇貝19個EST-SSRs位點的遺傳方式進行了分析。其中3個家系位點組合嚴重了偏離孟德爾遺傳，諾拋開無效等位形式的影響，則僅有1個位點不符合。在重新設(shè)計引物后，發(fā)現(xiàn)是引物序列包含單核苷酸突變引起無效等

24、位基因的[5]。因此，對海灣扇貝種群進行研究或者親子鑒定之前，應(yīng)進一步的分析所用的微衛(wèi)星標記的無效等位形式。</p><p>　　4.1.3 物種鑒定</p><p>　　扇貝幼蟲的鑒定和區(qū)分是相當困難的?；菝鬧15]利用由8個扇貝微衛(wèi)星組成一套組合，用來鑒定扇貝主要的4個養(yǎng)殖種類。這種方法受微衛(wèi)星標記的物種特異性的影響很大，用此法能夠檢測出混合浮游的幼蟲中1%的個體，具有較好的準確性和靈

25、敏性。</p><p>　　4.2微衛(wèi)星標記的研究進展</p><p>　　現(xiàn)階段DNA分子標記的劃分方法有很多，其中有：①基于PCR反應(yīng)及不基于PCR反應(yīng)的劃分分法；②Ⅰ型標記（與基因有連鎖關(guān)系的標記）和Ⅱ型標記(與基因沒有連鎖的標記)劃分法；③顯性與共顯性劃分法，等等。共顯性和重復(fù)性、可比性高是微衛(wèi)星標記的優(yōu)點，使其具有所獲長期資料的比對功能；另一個明顯的優(yōu)勢就是隨著工作的積累其應(yīng)用價

26、值會越來越大[4]。</p><p>　　隨著技術(shù)的成熟，加上有價值的序列豐富的資源，獲得微衛(wèi)星標記在技術(shù)上和方法上都不再困難。除極少數(shù)創(chuàng)新性微衛(wèi)星克隆技術(shù)出現(xiàn)以外，微衛(wèi)星克隆的研究已不再是一個技術(shù)創(chuàng)新點，其重點將轉(zhuǎn)向以下幾方面[4]：①利用微衛(wèi)星序列鑒定出多態(tài)性高且擴增效果好的標記；②通過QTL定位來獲得微衛(wèi)星標記與某個性狀之間緊密連鎖的關(guān)系，這樣的微衛(wèi)星標記就升際為基因標記（Gene marker），并成為Ⅰ

27、型標記；③鑒定優(yōu)質(zhì)標記的基礎(chǔ)上進行應(yīng)用研究。在大力開發(fā)微衛(wèi)星標記時，應(yīng)注意到Ⅰ型標記與性狀相關(guān)基因連鎖在一起得可能性比一般的微衛(wèi)星標記要大，同時SNP標記能夠進行全自動分析，由此使得從cDNA序列中或者直接從基因組DNA序列中開發(fā)出SNP標記成為了當前分子標記領(lǐng)域研究的一大熱點。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 付春鵬,傅洪拓

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