豬干擾素誘導蛋白IP-10和Mx1克隆、表達及生物活性檢測.pdf

1、研究表明，干擾素的眾多生物學功能是通過其誘導的多種效應蛋白質來實現的。為了進一步研究干擾素抗病毒機理和研發(fā)抗病毒重組生物藥物，本實驗選取干擾素誘導產生的蛋白質中的兩個——IP-10蛋白和Mx1蛋白進行研究。
　　 1.豬干擾素誘導蛋白10(IP-10)的克隆表達及免疫活性檢測為了研究重組豬IP-10蛋白的生物學功能和對疫苗免疫活性的影響，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應RT-PCR的方法從豬脾臟組織中擴增豬IP-10基因，分別克隆到原

2、核表達載體pGEX-6P-1和真核表達載體pcDNA3.1/V5-HisA。將原核表達質粒pGEX-IP-10轉化到大腸桿菌株DH5α中，并用IPTG 于37℃誘導培養(yǎng)獲得表達，以純化的蛋白做免疫原免疫小鼠，制備出抗IP-10蛋白的陽性血清。將真核表達質粒pcDNA3.1-IP-10 轉染至HEK293T 細胞后,24h后經間接免疫熒光(IFA)和免疫印跡(western blot)檢測IP-10的表達。體外微室跨膜遷移實驗檢測HEK2

3、93T 細胞表達的IP-10 產物對脾淋巴細胞的趨化活性，并將有活性的蛋白作為佐劑和疫苗一起免疫動物，測定其對疫苗免疫的調節(jié)作用。
　　 結果顯示，雙酶切鑒定和核酸序列分析證實pGEX-IP-10和pcDNA3.1-IP-10表達質粒構建成功。免疫小鼠產生的陽性血清稀釋到1:10 萬時A450的值大于未免疫小鼠血清的A450的值即P/N>2.1，說明顯示免疫小鼠產生了抗豬IP-10蛋白的抗體即得到了抗IP-10蛋白的高免血清。真

4、核表達質粒轉染HEK293T 細胞后，IFA能夠檢測到IP-10蛋白的表達，Western blotting 顯示表達的融合蛋白分子量約為17KD。體外微室跨膜遷移實驗和動物實驗證明重組IP-10蛋白對豬脾淋巴細胞具有趨化活性，且能產生一定的免疫增強作用。
　　 2.豬Mx1基因的克隆與真核表達根據已發(fā)表的Mx1蛋白的cDNA基因序列，設計一對特異性引物，應用反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術從豬瘟弱毒疫苗和Poly：I

5、C 共刺激7小時的PK15 細胞的總RNA中擴增出編碼Mx1蛋白的全長基因，并通過引物設計填補了PK15 細胞系Mx1 cDNA序列中3'端缺失的11bp，成功獲得Mx1蛋白完整基因的克隆。構建了重組真核表達質粒pRetroQ-sMx1，轉染HEK293T 細胞并表達Mx1蛋白，綠色熒光檢測和免疫印跡(western blot)檢測重組蛋白的表達，然后利用微量細胞病變抑制法測定其抗病毒活性。
　　 結果顯示，雙酶切鑒定和核酸序列