擬穴青蟹凋亡抑制蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA克隆與干露脅迫下表達(dá)分析.pdf

1、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國(guó)東南沿海主要的海水養(yǎng)殖蟹類之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著人們生活水平的提高，擬穴青蟹無(wú)水?；钸\(yùn)輸變得越來(lái)越普遍，但該運(yùn)輸方式使擬穴青蟹處于一種無(wú)水干露狀態(tài)，隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)常會(huì)導(dǎo)致一定比例的青蟹死亡，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。干露會(huì)引起失水，導(dǎo)致擬穴青蟹組織缺氧，使細(xì)胞處于低氧狀態(tài)，從而引起細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起細(xì)胞死亡。凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis p

2、rotein，IAP)是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因之一，目前有關(guān)IAP基因在蟹類中尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆策略和RACE技術(shù)在擬穴青蟹中成功克隆得到IAP基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分析了LAP基因核苷酸序列、氨基酸序列結(jié)構(gòu)，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)分析了IAP基因在擬穴青蟹不同組織中的表達(dá)情況，以及干露脅迫下擬穴青蟹肝胰腺中IAP基因的表達(dá)量。同時(shí)，采用RNA干擾技術(shù)對(duì)擬穴青蟹IAP基因進(jìn)行干擾后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了干露脅迫下擬穴青蟹

3、肝胰腺細(xì)胞的凋亡情況。
　　擬穴青蟹IAP基因全長(zhǎng)為3351 bp，包括1986 bp的ORF，編碼662個(gè)氨基酸，5'-UTR（5'端非編碼區(qū)）為270bp，3'-UTR（3'端非編碼區(qū)）為1095 bp，GenBank的登錄號(hào)為KT965726。生物信息學(xué)分析表明擬穴青蟹IAP蛋白具有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域。Blast分析比對(duì)顯示，擬穴青蟹IAP基因與與南美白對(duì)蝦（Penaeus monodon）、羅氏沼蝦（Ma

4、crobrachium rosenbergii）和凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的IAP基因同源性最高，均為49％。NJ進(jìn)化樹(shù)表明擬穴青蟹首先與羅氏沼蝦等甲殼動(dòng)物聚在一起，且與家蠶等昆蟲(chóng)親緣關(guān)系較近，聚為一支。
　　經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，擬穴青蟹IAP基因在鰓、肝胰腺、肌肉、心、胃、眼柄和血細(xì)胞等7個(gè)組織中均有表達(dá)，且表達(dá)量不同。結(jié)果顯示擬穴青蟹IAP基因在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次為肌肉，在血細(xì)胞中表達(dá)

5、量最低。擬穴青蟹IAP基因在鰓、胃、心和眼柄中表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。干露6h后肝胰腺中 SpIAP基因的表達(dá)開(kāi)始上升，12h顯著升高(p＜0.05)，到24h達(dá)到最高（為初始值的7.5倍），后逐漸減低。
　　RNA干擾結(jié)果顯示，注射siRNA組IAP基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而對(duì)照組(空白、注射PBS及注射random-siRNA)相互之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明注射的siRNA有顯著的干