八氫番茄紅素合成酶基因(TaPSY2)的克隆轉(zhuǎn)化及抗菌肽制備的研究.pdf

1、在所有植物中類胡蘿卜素占著很重要的一部分，是自然界分布最廣、種類最豐富的色素，在藍(lán)細(xì)菌、藻類、動物及植物中充當(dāng)著重要的生物功能。在植物中，類胡蘿卜素屬于光合作用的色素，它為光合作用捕獲光能；在花和果實中，類胡蘿卜素對顏色也起著非常重要的作用，包含了很多從黃色到紅色的色素，它影響改變花色。類胡蘿卜素在保護(hù)人類健康方面起著非常重要的作用，尤其是β-胡蘿卜素，不僅是維生素A的前體，而且還具有預(yù)防心血管疾病、增強人體免疫力、延緩衰老和抗癌等的作

2、用。類胡蘿卜素的藥用保健作用越來越引起人們的密切關(guān)注。因此，利用基因工程的手段，可以調(diào)控植物類胡蘿卜素的代謝和積累，改變花色、改良果蔬品質(zhì)。
　　 小麥種子中類胡蘿卜素的積累決定了小麥胚乳的顏色，它是評價小麥營養(yǎng)品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，而八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)在類胡蘿卜素生物合成中是一個重要的關(guān)鍵酶，和胚乳中類胡蘿卜素的積累密切關(guān)聯(lián)。
　　 本研究主要利用RACE法從小麥中克隆了PSY基因，構(gòu)建了植物表達(dá)載體，并利

3、用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將導(dǎo)肽tp和細(xì)菌中的八氫番茄紅素合成酶基因（crtB）基因?qū)霐M南芥，獲得以下結(jié)果。
　　 1）通過RACE技術(shù)克隆了小麥PSY基因的部分cDNA，序列長為1,150 bp，推測編碼304個氨基酸，分子量大約33.9 kDa。
　　 2）小麥的PSY基因與其它植物PSY基因高度同源,相似性在60％－90％之間。其中與水稻、玉米中PSY2的同源性最高達(dá)到90％以上，進(jìn)化分析表明，PSY基因在植物進(jìn)化上是高

4、度保守的。軟件分析表明我們克隆的PSY基因?qū)儆赑SY2 群，我們將該基因命名為TaPSY2。
　　 3）利用PCR技術(shù)擴增出tp和crtB基因，均連接到pMD18-T載體并經(jīng)測序確定后，通過中間載體pBlue-script KS將tp和crtB基因連接起來，然后將tp和crtB基因連接到植物雙元載體pBI121-napA的種子特異性啟動子（napA）的后面。測序確定后將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，經(jīng)菌液和質(zhì)粒PC

5、R分析，獲得了真核表達(dá)載體pBI121-tp-crtB。
　　 4）利用農(nóng)桿菌花序浸染法將植物表達(dá)載體pBI121-tp-crtB轉(zhuǎn)入擬南芥野生型Columbia（Col）中，共獲得14株轉(zhuǎn)基因系，并進(jìn)行了萌發(fā)實驗，結(jié)果表明tp-crtB基因不影響擬南芥正常的發(fā)育過程。
　　 我們還做了其它兩方面的研究：
　　 1）利用PCR技術(shù)快速制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物，DNA分子量條帶分布適度、亮度清晰。制備的DNA分子