棉花、煙草響應低溫脅迫的差異蛋白質組學研究.pdf

1、植物在長期的進化過程中具備了各種不同的生理生化機制，以抵抗、適應各種逆境。在眾多非生物脅迫中，低溫是限制許多重要作物產(chǎn)量和分布的重要環(huán)境因素。植物通過改變形態(tài)、生理和生化過程，使脅迫應答基因表達，合成特殊的蛋白質來響應低溫脅迫。到目前為止，關于低溫脅迫對植物生長發(fā)育以及各種代謝活動影響產(chǎn)生的機理還不清楚。本研究利用差異蛋白質組學策略首次對低溫脅迫下棉花幼苗、煙草懸浮細胞蛋白質組變化以及外源轉錄因子CBF1A表達對煙草懸浮細胞蛋白質組的影

2、響進行了研究，以期為揭示植物對低溫脅迫響應的分子機制提供依據(jù)。 1、利用差異蛋白質組學策略，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法(TCA/acetone precipitation)提取棉花幼苗總蛋白質，建立了棉花幼苗蛋白質雙向電泳體系；雙向電泳凝膠經(jīng)銀染和考馬斯亮藍R-350熱染，掃描獲取電泳圖片，利用ImageMaster2DPlatium Software分析比較低溫脅迫處理幼苗與未低溫處理幼苗的蛋白質組差異；發(fā)現(xiàn)銀染的凝膠中有54個

3、差異表達蛋白點，其中29個蛋白點在低溫處理后表達量升高，25個蛋白點表達量降低；利用質譜技術成功鑒定出其中的8個差異表達蛋白點，其中的7個蛋白點被鑒定為同一種蛋白β-球蛋白，另一種蛋白鑒定為Rubisco大亞基；通過對棉花子葉生理生化指標的測定發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會引起棉花幼苗子葉肽鏈內切酶活性的增強；子葉凈光合速率和羧化效率降低；棉花子葉內活性氧產(chǎn)生速率升高，脂質過氧化加速?；谏鲜鼋Y果，我們認為低溫脅迫會加速β-球蛋白和Rubisco大亞

4、基的降解，并對蛋白的降解模式進行了分析。本文為從分子水平上揭示棉花幼苗低溫響應機制研究奠定了基礎，為深入了解低溫脅迫下蛋白的降解機制提供了依據(jù)。 2、利用差異蛋白質組學策略，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取煙草懸浮細胞總蛋白質，建立了煙草懸浮細胞蛋白質雙向電泳體系；分析比較了煙草懸浮細胞在低溫脅迫處理后蛋白質組的變化，通過對差異表達蛋白點的鑒定，發(fā)現(xiàn)LEA-類似蛋白NtLEA7-3的豐度在低溫處理后上調，為低溫誘導表達升高蛋白。通過

5、熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下該蛋白mRNA水平變化與蛋白表達水平變化情況基本一致。利用RACE技術得到NtLEA7-3基因全長cDNA(GenBank登錄號：EF532409)。NtLEA7-3 cDNA全長為1267 bp，該序列含有一個969 bp的完整開放讀碼框，編碼322個氨基酸，蛋白質理論分子量約為35.7 kDa，等電點為4.86。對NtLEA7-3編碼的蛋白質進行結構預測分析表明，該蛋白富含無規(guī)卷曲(Coil)，高達6

6、5.31％，其次是α-螺旋(Helix)，為19.69％，而β-折疊(Strand)只有15.00％。將NtLEA7-3編碼區(qū)插入原核表達載體pET30a(+)，并轉化到大腸桿菌菌株BL21中，經(jīng)IPTG誘導，NtLEA7-3融合蛋白在BL21菌株中成功表達。將得到的NtLEA7-3編碼區(qū)插入植物表達載體pBI121中，構建了NtLEA7-3植物表達載體pBI121-LEA；成功地將其轉入到煙草和懸浮細胞中，獲得了轉基因煙草植株及懸浮細

7、胞，通過對轉基因植株及懸浮細胞的表型和低溫脅迫下生理生化特征分析表明，NtLEA7-3成功地表達可以提高轉基因植株和懸浮細胞的耐低溫脅迫能力。將NtLEA7-3編碼區(qū)插入含有GFP基因的植物表達載體pBI121中，構建了NtLEA7-3-GFP的植物表達載體pBI121-LEA-GFP，成功地將NtLEA7-3-GFP融合基因轉入擬南芥和煙草懸浮細胞，發(fā)現(xiàn)NtLEA7-3定位于細胞核中。本文不僅為研究植物的抗逆機理提供了參考，為植物抗性

8、育種提供了有效的候選基因，同時為深入研究NtLEA7-3的結構、功能和分子調控機制奠定了基礎。 3、成功地將棉花低溫脅迫相關轉錄因子CBF1A基因轉入了煙草懸浮細胞中，利用差異蛋白質組學策略分析了轉CBF1A基因煙草懸浮細胞和野生型煙草懸浮細胞的蛋白質組差異，發(fā)現(xiàn)外源CBF1A基因的表達會引起煙草懸浮細胞蛋白質組的變化，有7個蛋白點表達差異顯著，其中4個蛋白點表達升高，3個蛋白點表達降低。利用質譜技術成功鑒定出其中6個蛋白點，代