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文檔簡介
1、牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的,主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反芻動物及豬的一種重要傳染病。牛病毒性腹瀉病毒屬于黃病毒科 (Flaviviridae) 瘟病毒屬(Pestivirus)。牛病毒性腹瀉病毒感染動物機體后,可以使動物的生殖、呼吸、循環(huán)、免疫、淋巴細胞、肌肉與骨骼系統(tǒng)、皮膚、中樞神經等諸多系統(tǒng)產生相應的病理變化;同時導致動物繁殖率下降,給畜牧業(yè)造成嚴重的經濟
2、損失。對于本病國內外尚無可靠有效的商品化疫苗,所以盡快搞清楚本病的致病機理,對于研制出更加安全可靠有效的疫苗、控制本病發(fā)生和蔓延就顯得尤為重要。本試驗擬通過研究不同生物型BVDV感染體外培養(yǎng)的牛外周血單核細胞后干擾素、Th1/Th2 型細胞因子、Toll 樣受體 mRNA的轉錄情況,以達到了解病毒感染后動物機體細胞后免疫功能狀態(tài),為進一步探討 BVDV 感染動物的發(fā)病機理和持續(xù)感染的分子調節(jié)機制提供參考。
本試驗建立了檢測
3、牛IFN、Th1/Th2細胞因子和 TLR基因的SYBR-Green 1 實時熒光定量 PCR 方法。根據 GenBank 上牛 IFN (BoIFN-α、-β、-γ)、Th1/Th2 (BoIL-2,4,6,8、TNF-α)和 TLR (BoTLR-3,4,7,8)基因的序列,在保守區(qū)設計并合成各自特異引物,并以牛3-磷酸甘油脫氫酶 (GAPDH)基因為內參,采用 SYBR Green I 染料以建立實時熒光定量 PCR 檢測方法。將
4、 IFN、Th1/Th2細胞因子和 TLR基因克隆測序,將所得陽性重組質粒,作為標準品模板建立 SYBR-Green 1 熒光定量 PCR 標準曲線并做溶解曲線分析,并做靈敏性、特異性和重復性試驗。結果表明,牛IFN、Th1/Th2細胞因子、TLR和 GAPDH基因的Ct 值與標準品稀釋度在 1×101~1×109 copies/μL 范圍分別呈良好的線性關系,相關系數(shù)均大于 0.991。熔解曲線分析表明,產物為特異的單峰,特異性和重復
5、性較好,為在 mRNA 水平對牛 IFN、Th1/Th2細胞因子和 TLR基因的定量分析奠定了基礎。
應用上述建立的細胞因子檢測方法,我們測定了非致細胞病變型(noncytopathic,NCP)型和致細胞病變型(cytopathic,CP)型 BVDV 感染外周血單核細胞后IFN、Th1/Th2細胞因子、促炎性細胞因子和TLR mRNA的轉錄水平,結果表明:在NCP型BVDV 感染前期IFN-γ、TNF-α、IL-2、T
6、LR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出上調表達的趨勢,在CP型BVDV 感染前期TNFα、IL-4、IL-6、TLR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出上調表達的趨勢;在NCP型 BVDV感染后期IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、TLR-3、TLR-4、TLR-7和TLR-8 呈現(xiàn)出上調表達趨勢,在CP 型 BVDV感染后期IFN-α、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、TLR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出明顯的上調表達趨勢;總而言之,N
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