牛病毒性腹瀉病毒調節(jié)牛外周血單核細胞IFN、Th1-Th2細胞因子和TLR mRNA轉錄的研究.pdf

1、牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反芻動物及豬的一種重要傳染病。牛病毒性腹瀉病毒屬于黃病毒科 (Flaviviridae) 瘟病毒屬（Pestivirus）。牛病毒性腹瀉病毒感染動物機體后，可以使動物的生殖、呼吸、循環(huán)、免疫、淋巴細胞、肌肉與骨骼系統(tǒng)、皮膚、中樞神經等諸多系統(tǒng)產生相應的病理變化；同時導致動物繁殖率下降，給畜牧業(yè)造成嚴重的經濟

2、損失。對于本病國內外尚無可靠有效的商品化疫苗，所以盡快搞清楚本病的致病機理，對于研制出更加安全可靠有效的疫苗、控制本病發(fā)生和蔓延就顯得尤為重要。本試驗擬通過研究不同生物型BVDV感染體外培養(yǎng)的牛外周血單核細胞后干擾素、Th1/Th2 型細胞因子、Toll 樣受體 mRNA的轉錄情況，以達到了解病毒感染后動物機體細胞后免疫功能狀態(tài)，為進一步探討 BVDV 感染動物的發(fā)病機理和持續(xù)感染的分子調節(jié)機制提供參考。
　　 本試驗建立了檢測

3、牛IFN、Th1/Th2細胞因子和 TLR基因的SYBR-Green 1 實時熒光定量 PCR 方法。根據 GenBank 上牛 IFN (BoIFN-α、-β、-γ)、Th1/Th2 (BoIL-2,4,6,8、TNF-α)和 TLR (BoTLR-3,4,7,8)基因的序列，在保守區(qū)設計并合成各自特異引物，并以牛3-磷酸甘油脫氫酶 (GAPDH)基因為內參，采用 SYBR Green I 染料以建立實時熒光定量 PCR 檢測方法。將

4、 IFN、Th1/Th2細胞因子和 TLR基因克隆測序，將所得陽性重組質粒，作為標準品模板建立 SYBR-Green 1 熒光定量 PCR 標準曲線并做溶解曲線分析，并做靈敏性、特異性和重復性試驗。結果表明，牛IFN、Th1/Th2細胞因子、TLR和 GAPDH基因的Ct 值與標準品稀釋度在 1×101～1×109 copies/μL 范圍分別呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于 0.991。熔解曲線分析表明，產物為特異的單峰，特異性和重復

5、性較好，為在 mRNA 水平對牛 IFN、Th1/Th2細胞因子和 TLR基因的定量分析奠定了基礎。
　　 應用上述建立的細胞因子檢測方法，我們測定了非致細胞病變型（noncytopathic，NCP）型和致細胞病變型（cytopathic，CP）型 BVDV 感染外周血單核細胞后IFN、Th1/Th2細胞因子、促炎性細胞因子和TLR mRNA的轉錄水平，結果表明：在NCP型BVDV 感染前期IFN-γ、TNF-α、IL-2、T

6、LR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出上調表達的趨勢，在CP型BVDV 感染前期TNFα、IL-4、IL-6、TLR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出上調表達的趨勢；在NCP型 BVDV感染后期IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、TLR-3、TLR-4、TLR-7和TLR-8 呈現(xiàn)出上調表達趨勢，在CP 型 BVDV感染后期IFN-α、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、TLR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出明顯的上調表達趨勢；總而言之，N