幾種產(chǎn)毒海洋微藻的膜分類(lèi)芯片檢測(cè)技術(shù).pdf

1、赤潮作為一種長(zhǎng)期存在的海洋災(zāi)害，不僅會(huì)給捕撈業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和近海旅游造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)通過(guò)多種方式導(dǎo)致海洋生物大量死亡，破壞生態(tài)環(huán)境，特別是毒素通過(guò)食物鏈，空氣傳播危及人類(lèi)身體健康。因此，赤潮的監(jiān)測(cè)和預(yù)防十分重要。要對(duì)赤潮進(jìn)行預(yù)警和監(jiān)測(cè)，首要需要對(duì)赤潮藻種進(jìn)行準(zhǔn)確的分類(lèi)和鑒定，其次是建立快速準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)藻種。鑒于赤潮藻個(gè)體微小、分類(lèi)學(xué)復(fù)雜的特點(diǎn)和傳統(tǒng)鑒定法的局限性，本研究將PCR技術(shù)和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)有效結(jié)合，建立了一種新型的檢

2、測(cè)方法——膜分類(lèi)芯片檢測(cè)技術(shù)，不僅可以達(dá)到種屬間的區(qū)分，還有同時(shí)檢測(cè)多種藻，有檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
　　研究選取了6種產(chǎn)毒的海洋微藻（劇毒卡爾藻、米氏凱倫藻、強(qiáng)壯前溝藻、利瑪原甲藻、赤潮異灣藻和塔瑪亞歷山大藻）為研究對(duì)象，首先對(duì)它們的核糖體大亞基D1–D2區(qū)進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得堿基序列；其次，將獲得的序列應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析，目測(cè)確定序列特異性區(qū)域，作為探針序列；最后，采用斑點(diǎn)雜交對(duì)探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　建立的

3、膜分類(lèi)芯片檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)流程如下：（1）探針加尾：對(duì)特異性探針加尾，以固定在膜上；（2）膜分類(lèi)芯片的制備：在陣列設(shè)計(jì)好的尼龍膜上進(jìn)行探針點(diǎn)樣，并通過(guò)紫外交聯(lián)固定，制備好膜分類(lèi)芯片；（3）雜交靶序列的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記：提取6種產(chǎn)毒微藻的基因組作為模板，并對(duì)核糖體大亞基D1–D2片段進(jìn)行生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增；（4）核酸雜交：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性并與膜分類(lèi)芯片進(jìn)行雜交；（5）顯色：通過(guò)堿性磷酸酶偶聯(lián)生物素抗體與生物素標(biāo)記結(jié)合，以及酶介導(dǎo)B

4、CIP/NBT顯色反應(yīng)，形成可見(jiàn)斑點(diǎn)。
　　對(duì)建立的膜分類(lèi)芯片檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括探針的紫外交聯(lián)固定時(shí)間、探針上樣量、生物素標(biāo)記產(chǎn)物雜交濃度、雜交時(shí)間、雜交溫度和洗膜溫度，優(yōu)化結(jié)果如下：紫外交聯(lián)0.5–1.0 min，探針上樣量為15 ng，產(chǎn)物反應(yīng)濃度150–300 ng/ml，雜交時(shí)間為2 h，雜交溫度為44℃，洗膜溫度為46–48℃。為了降低標(biāo)記生物素的成本，采用生物素?fù)饺霕?biāo)記、生物素引物標(biāo)記和PCR-隨機(jī)引物

5、擴(kuò)增標(biāo)記三種方法，結(jié)果顯示生物素引物標(biāo)記法成本最低且芯片檢測(cè)效果最好，因此，生物素引物標(biāo)記法為最佳標(biāo)記方法。此外，為了提高芯片檢測(cè)靈敏度，采用三種細(xì)胞處理方法優(yōu)化，包括CTAB提取DNA法、一管式植物DNA抽提試劑盒法和裂解緩沖液法，結(jié)果顯示一管式植物DNA抽提法靈敏度最高，可以檢測(cè)到0.5個(gè)細(xì)胞，但反應(yīng)產(chǎn)物不易保存，CTAB法斑點(diǎn)灰度值最高，能檢測(cè)到5個(gè)細(xì)胞，能長(zhǎng)期保存，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇。
　　進(jìn)行了非目標(biāo)基因組干擾實(shí)驗(yàn)，將非