幾種產(chǎn)毒海洋微藻的膜分類芯片檢測(cè)技術(shù).pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、赤潮作為一種長期存在的海洋災(zāi)害,不僅會(huì)給捕撈業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和近海旅游造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,還會(huì)通過多種方式導(dǎo)致海洋生物大量死亡,破壞生態(tài)環(huán)境,特別是毒素通過食物鏈,空氣傳播危及人類身體健康。因此,赤潮的監(jiān)測(cè)和預(yù)防十分重要。要對(duì)赤潮進(jìn)行預(yù)警和監(jiān)測(cè),首要需要對(duì)赤潮藻種進(jìn)行準(zhǔn)確的分類和鑒定,其次是建立快速準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)藻種。鑒于赤潮藻個(gè)體微小、分類學(xué)復(fù)雜的特點(diǎn)和傳統(tǒng)鑒定法的局限性,本研究將PCR技術(shù)和反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)有效結(jié)合,建立了一種新型的檢

2、測(cè)方法——膜分類芯片檢測(cè)技術(shù),不僅可以達(dá)到種屬間的區(qū)分,還有同時(shí)檢測(cè)多種藻,有檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
  研究選取了6種產(chǎn)毒的海洋微藻(劇毒卡爾藻、米氏凱倫藻、強(qiáng)壯前溝藻、利瑪原甲藻、赤潮異灣藻和塔瑪亞歷山大藻)為研究對(duì)象,首先對(duì)它們的核糖體大亞基D1–D2區(qū)進(jìn)行克隆測(cè)序,獲得堿基序列;其次,將獲得的序列應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)分析,目測(cè)確定序列特異性區(qū)域,作為探針序列;最后,采用斑點(diǎn)雜交對(duì)探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
  建立的

3、膜分類芯片檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)流程如下:(1)探針加尾:對(duì)特異性探針加尾,以固定在膜上;(2)膜分類芯片的制備:在陣列設(shè)計(jì)好的尼龍膜上進(jìn)行探針點(diǎn)樣,并通過紫外交聯(lián)固定,制備好膜分類芯片;(3)雜交靶序列的PCR擴(kuò)增和標(biāo)記:提取6種產(chǎn)毒微藻的基因組作為模板,并對(duì)核糖體大亞基D1–D2片段進(jìn)行生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增;(4)核酸雜交:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性并與膜分類芯片進(jìn)行雜交;(5)顯色:通過堿性磷酸酶偶聯(lián)生物素抗體與生物素標(biāo)記結(jié)合,以及酶介導(dǎo)B

4、CIP/NBT顯色反應(yīng),形成可見斑點(diǎn)。
  對(duì)建立的膜分類芯片檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,包括探針的紫外交聯(lián)固定時(shí)間、探針上樣量、生物素標(biāo)記產(chǎn)物雜交濃度、雜交時(shí)間、雜交溫度和洗膜溫度,優(yōu)化結(jié)果如下:紫外交聯(lián)0.5–1.0 min,探針上樣量為15 ng,產(chǎn)物反應(yīng)濃度150–300 ng/ml,雜交時(shí)間為2 h,雜交溫度為44℃,洗膜溫度為46–48℃。為了降低標(biāo)記生物素的成本,采用生物素?fù)饺霕?biāo)記、生物素引物標(biāo)記和PCR-隨機(jī)引物

5、擴(kuò)增標(biāo)記三種方法,結(jié)果顯示生物素引物標(biāo)記法成本最低且芯片檢測(cè)效果最好,因此,生物素引物標(biāo)記法為最佳標(biāo)記方法。此外,為了提高芯片檢測(cè)靈敏度,采用三種細(xì)胞處理方法優(yōu)化,包括CTAB提取DNA法、一管式植物DNA抽提試劑盒法和裂解緩沖液法,結(jié)果顯示一管式植物DNA抽提法靈敏度最高,可以檢測(cè)到0.5個(gè)細(xì)胞,但反應(yīng)產(chǎn)物不易保存,CTAB法斑點(diǎn)灰度值最高,能檢測(cè)到5個(gè)細(xì)胞,能長期保存,可根據(jù)需求進(jìn)行選擇。
  進(jìn)行了非目標(biāo)基因組干擾實(shí)驗(yàn),將非

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