馬鈴薯脫氫抗壞血酸還原酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、維生素C又稱(chēng)抗壞血酸(L-ascorbic acid，AsA)，一種普遍存在于植物組織的抗氧化物質(zhì)，也是人類(lèi)必需的重要維生素。由于人體缺乏合成AsA的能力，必須從蔬菜水果中獲得，因此其成為衡量蔬菜品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。植物中AsA的重要性還在于提高植株的AsA水平，對(duì)于增強(qiáng)植物自身的抗氧化能力和光合保護(hù)能力以及促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等都具有非常重要的意義。 脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)是植物抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的關(guān)鍵酶。本研究從馬鈴薯

2、葉片中克隆到分別存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的DHAR兩個(gè)同工酶基因。研究了該基因在馬鈴薯各器官中表達(dá)量與AsA器官分布的關(guān)系以及其表達(dá)水平與馬鈴薯溫度脅迫耐受能力的關(guān)系。然后分別將兩種基因?qū)腭R鈴薯使其過(guò)量表達(dá)，進(jìn)一步研究其在馬鈴薯AsA代謝中的功能。主要結(jié)果如下： 1.葉片和莖的AsA+DHA含量與GalLDH活性顯著相關(guān)，而AsA含量與DHAR活性顯著相關(guān)。說(shuō)明在馬鈴薯幼葉中高含量的AsA可能歸因于DHAR和GalLDH的高活性；

3、而AsA在馬鈴薯塊莖的積累，主要來(lái)自于葉片的運(yùn)輸和DHAR催化的DHA再生。在地上部DHAR兩同工酶基因共同調(diào)控DHAR的活性，但在塊莖中主要是細(xì)胞質(zhì)DHAR基因起作用。 2.40℃和5℃下，AsA含量快速增加，而后急速減少。DHAR、GalLDH、APX、MDHAR及GR活性也呈與之相似的先升后降的變化趨勢(shì)。DHAR基因表達(dá)變化趨勢(shì)與其酶活性一致，說(shuō)明DHAR兩同工酶基因均能通過(guò)調(diào)控其表達(dá)量參與對(duì)AsA含量的調(diào)控，并以此來(lái)抵御

4、溫度脅迫對(duì)植物帶來(lái)的氧化傷害。 3.從馬鈴薯葉片中成功獲得了DHAR位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中兩個(gè)同工酶基因的全長(zhǎng)，命名為SrDHAR1和SrDHAR2，GeneBank注冊(cè)號(hào)分別為EF030707和FJ477252。對(duì)兩基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，SrDHAR1和SrDHAR2編碼的蛋白質(zhì)生理功能基本相同，唯一不同的是SrDHAR2含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽cTP，可以在蛋白質(zhì)合成完成后被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中。 4.將獲得的SrDHAR1

5、和SrDHAR2基因分別與含有35S啟動(dòng)子的pBI121載體重組，構(gòu)建正義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯。通過(guò)PCR及熒光定量PCR的方法對(duì)帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果證明成功獲得了轉(zhuǎn)正義基因的馬鈴薯植株。 5.SrDHAR1過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的葉片和塊莖DHAR活性、AsA和AsA+DHA含量及AsA/DHA均比野生型顯著增加。SrDHAR2過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的葉片DHAR活性、AsA和AsA+DHA含量及A

6、sA/DHA顯著增加，但塊莖中上述指標(biāo)沒(méi)有顯著變化，表明SrDHAR2僅在含葉綠體的器官中表達(dá)，在葉片中的過(guò)量表達(dá)未影響塊莖DHAR活性和AsA含量。 6.SrDHAR1和SrDHAR2的過(guò)量表達(dá)均能提高葉片中葉綠素含量和葉片光合速率。并且SrDHAR2過(guò)量表達(dá)植株的葉片葉綠素含量和光合速率的增幅均大于SrDHAR1過(guò)量表達(dá)植株，說(shuō)明葉綠體DHAR的過(guò)量表達(dá)對(duì)穩(wěn)定植株葉綠素，增強(qiáng)光合作用的效果更大。 7.SrDHAR1和