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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:探討Ghrelin、GHS-Rla在下丘腦-垂體-性腺上的定位以及Ghrelin mRNA在其上的表達(dá)。分析Ghrelin mRNA和GHS-RlamRNA在不同發(fā)情周期大鼠下丘腦-垂體-卵巢上的表達(dá)豐度。研究外源性Ghrelin對(duì)促性腺激素、性腺激素的分泌及其基因表達(dá)的影響。從而揭示Ghrelin對(duì)大鼠生殖軸的作用途徑和機(jī)理。
方法:(1)分離成年SD大鼠的下丘腦、垂體、卵巢和睪丸,經(jīng)4%多聚甲醛固定,制成石蠟切片
2、,采用免疫組織化學(xué)方法觀察Ghrelin及其受體GHS-R]a在上述組織中的定位。(2)使用地高辛標(biāo)記的Ghrelin寡核苷酸探針,采用原位雜交方法觀察Ghrelin mRNA在下丘腦、垂體、卵巢和睪丸中的表達(dá)。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析Ghrelin mRNA和GHS-Rla mRNA在不同發(fā)情周期大鼠下丘腦、垂體、卵巢上的表達(dá)豐度。(4)采用1%的戊巴比妥鈉1mL對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀,采用不同劑量的G
3、hrelin(0.3nmol、1nmol、3nmol和生理鹽水對(duì)照組)對(duì)雄性大鼠和不同發(fā)情周期大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射,15min后斷頭采血,酶聯(lián)免疫分析法測(cè)血清促黃體素、促卵泡素濃度,放射免疫分析法測(cè)血清睪酮、雌激素和孕酮的濃度。(5)分離試驗(yàn)四大鼠的下丘腦、垂體、卵巢和睪丸,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析FSH、LH、GnRH、AR、ERβ和PRA+B mRNA表達(dá)豐度。(6)成年雄性大鼠和25 d的雌性大鼠斷頭處死,收集睪丸間質(zhì)細(xì)胞、黃體細(xì)胞
4、和顆粒細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6h,收集培養(yǎng)液和細(xì)胞,采用酶聯(lián)免疫、放射免疫分析法測(cè)培養(yǎng)液中睪酮、雌激素和孕酮的濃度,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析AR、ERβ和PRA+BmRNA的表達(dá)豐度。
結(jié)果:(1)Ghrelin與其受體GHS-Rla在下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、正中隆起,腺垂體,睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精母細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞,卵母細(xì)胞等中均有分布。(2)在下丘腦、垂體、睪丸中,Ghrelin mRNA顯示和Ghrelin一致的分布方
5、式,在卵巢中,顯示出差異性表達(dá)。(3)Ghrelin和GHS-Rla在不同發(fā)情周期大鼠的下丘腦、垂體中均有表達(dá),且其表達(dá)豐度隨發(fā)情周期的變化而變化。在卵巢中僅發(fā)現(xiàn)Ghrelin mRNA表達(dá),在整個(gè)發(fā)情周期均未檢測(cè)到GHS-Rla mRNA表達(dá)。(4)側(cè)腦室注射Ghrelin能抑制促性腺激素、性腺激素的分泌,其作用效果與所處發(fā)情周期、注射的劑量、性別有關(guān)。(5)側(cè)腦室注射Ghrelin顯著抑制GnRH mRNA、FSH mRNA、LH
6、mRNA、ERβmRNA、PRA+B mRNA、AR mRNA的表達(dá),其抑制效果與注射劑量與所處發(fā)情周期有關(guān)。(6)在體外,Ghrelin顯著抑制孕酮、雌激素的分泌和ERβ mRNA、PRA+B mRNA的表達(dá)。但對(duì)睪酮的分泌、AR mRNA的表達(dá)不起作用。
結(jié)論:Ghrelin、GHS-Rla和Ghrelin mRNA在大鼠下丘腦、垂體和性腺上均有分布,Ghrelin通過與其受體相互作用,在中樞和外周水平上抑制大鼠促性腺
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